Manual de Prácticas de Laboratorio de

Manual de Prácticas
de Laboratorio
de
Inmunología
Aplicada
Dra. Jessay Luna Vásquez
Dr. en C. Luis Daniel Hernández Ortega
Lic. en Químico Farmacobiólogo
Síntesis de Fármacos
Extracto del Reglamento de Laboratorios
de Química (D-CL-20) del Centro Universitario UTEG
Artículo 1.- El presente reglamento es obligatorio y de observancia general, tanto para
el personal como para los alumnos que conforman la comunidad universitaria UTEG, y
tiene por objeto regular el uso y conservación de los laboratorios y equipos
especializados en química, incluyendo a sus ramas disciplinarias, así como los
derechos y obligaciones de los usuarios y encargados de los mismos.
Artículo 3.- Para los efectos de este reglamento se entiende por:
a. Agente Infeccioso: microorganismo capaz de causar una enfermedad si se
reúnen las condiciones para ello y cuya presencia en un residuo lo hace
peligroso.
b. Laboratorio de Química: lugar habilitado con material e instrumentos
especializados para realizar investigaciones y experimentos de tipo científico, en
la materia de química incluyendo sus ramas disciplinarias.
c. Residuos Peligrosos: son aquellos que posean alguna de las características de
corrosividad, reactividad, explosividad, toxicidad, inflamabilidad, o que contengan
agentes infecciosos que les confieran peligrosidad, así como envases,
recipientes, embalajes y suelos que hayan sido contaminados cuando se
transfieran a otro sitio.
d. Residuos Peligroso Biológico-Infecciosos: aquellos clasificados como tales
en las Normas Oficiales Mexicanas, como la sangre, sus componentes y
derivados; cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos; desechos
patológicos como tejidos, órganos, cadáveres y partes de animales; muestras
biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico,
excluyendo orina y excremento; residuos no anatómicos como materiales de
curación que contengan algún tipo de líquido corporal y derivados de los
laboratorios; y objetos punzocortantes contaminados y no contaminados
(lancetas, jeringas, porta y cubreobjetos, navajas de bisturí).
e. Usuario: toda persona miembro de la comunidad universitaria UTEG, sea
personal académico, alumnos y trabajadores administrativos, que utilice o haga
uso de los laboratorios de química.
Artículo 6.- Toda persona que haga uso de los laboratorios deberá registrar su ingreso
en las bitácoras correspondientes que, para el efecto de registro, posea el centro
universitario, anotando su nombre, matricula o número de empleado y firma.
Artículo 7.- Todas las prácticas y/o experimentos que se realicen en los laboratorios
deberán estar supervisados por el docente de la asignatura correspondiente.
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III
Síntesis de Fármacos
Artículo 8.- Los usuarios deberán portar, al ingresar a los laboratorios, el siguiente
atuendo:
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.
Bata blanca de manga larga abotonada, con el logo de la institución.
Lentes de seguridad.
Paño o franela para limpiar su área de trabajo.
No usar lentes de contacto, quienes necesiten lentes correctivos deberán portar
anteojos.
Calzado cerrado, de piso, no de tela y suela antiderrapante (el zapato deberá
cubrir completamente el empeine; no se permitirá la entrada con zapato abierto o
semicerrado, con o sin calcetines).
Pantalón largo de mezclilla o gabardina de algodón. No se permite la entrada con
pantalón corto, faldas, blusas escotadas o de tirantes.
Cabello recogido (en el laboratorio que se requiera portar cofia).
Uñas cortas y limpias, sin esmalte.
No accesorios como aretes, anillos, cadenas, pulseras, esclavas y/o relojes.
Portar guantes de látex y cubre bocas (bajo indicación del docente, de acuerdo al
tipo de práctica y de laboratorio).
Mujeres sin maquillaje, de acuerdo al tipo de práctica y de laboratorio, bajo la
indicación del docente.
Asimismo, es obligatorio llevar a cabo la técnica de lavado de manos indicada por los
docentes al iniciar y al terminar la práctica.
Artículo 9.- El docente deberá identificar los riesgos específicos de cada práctica e
indicar las medidas y procedimientos de seguridad adecuados para su realización, en
especial si el alumno pudiera estar expuesto a situaciones de peligro o riesgo, con
sustancias peligrosas por el tipo de sus características explosivas, volátiles, corrosivas,
reactivas, tóxicas, inflamables o infeccionas.
Artículo 11.- Durante el desarrollo de las prácticas en los laboratorios, los docentes a
cargo son responsables directos del correcto uso de las instalaciones, material, equipo,
reactivos y sustancias, siendo su obligación reportar cualquier irregularidad descubierta
en los mismos, notificando por escrito de inmediato al personal a cargo de los
laboratorios, así como de los eventuales infractores en su caso.
Artículo 12.- El docente que utilice los laboratorios deberá permanecer en los mismos
hasta que concluya la práctica, siendo responsable de proporcionar una asesoría
adecuada y de calidad a los alumnos durante su desarrollo, así como del
comportamiento de los alumnos.
Artículo 13.- Los alumnos son responsables del material y equipo de los laboratorios
que empleen durante las prácticas. En caso de falla o desperfecto en los equipos,
deberán reportarlo de inmediato al docente a cargo de la práctica y/o al Técnico
Laboratorista y/o Coordinador de Laboratorios. Para el caso de que algún alumno
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Síntesis de Fármacos
rompa de manera accidental o intencionada el material o instrumentos del laboratorio,
deberá reponerlo en la misma calidad, cantidad y de la misma marca que el que le fue
entregado.
Artículo 14.- Son obligaciones de los usuarios de los Laboratorios de Química, las
siguientes:
a. Asistir con puntualidad a las prácticas.
b. Permanecer en orden y guardar silencio.
c. Abstenerse de jugar, correr, hacer bromas y emplear lenguaje inadecuado dentro
de las instalaciones.
d. Realizar el lavado de manos indicado por el docente antes de iniciar la práctica.
e. Atender a las indicaciones de vestimenta y atuendo indispensable para asistir a
las prácticas.
f. Acatar a la brevedad las indicaciones del docente o encargado del laboratorio y/o
técnico auxiliar de laboratorio.
g. Hacer un uso adecuado de las instalaciones, equipo, materiales, sustancias y/o
reactivos.
h. Respetar los horarios y condiciones de uso de los laboratorios y sus equipos
especializados.
i. Revisar con antelación al desarrollo de la práctica, en el manual correspondiente,
el material necesario para su realización, solicitado por el docente y/o técnico y/o
encargado de laboratorio, ya que sin él no podrán realizarla, ni ingresar al
laboratorio, sin excepción.
j. Atender a las indicaciones del docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio,
para la disposición final de las sustancias y reactivos empleados durante las
prácticas.
k. Localizar el equipo de seguridad para que, en cualquier contingencia, puedan
operarlo.
l. Usar solamente equipo que se encuentre en buenas condiciones y reportar
cualquier desperfecto de inmediato a su docente y/o encargado de laboratorio.
m. Guardar su material limpio, seco y completo en la gaveta asignada para tal
efecto.
n. Una vez concluida la actividad dentro del laboratorio, dejar en perfecto orden el
entorno en el cual estuvo trabajando; apagar y entregar equipos y materiales,
limpiar las mesas de trabajo, acomodar las bancas o sillas; retirar y limpiar los
papeles y elementos utilizados, y reportar cualquier falla del equipo.
Artículo 15.- Los alumnos tienen la posibilidad de alquilar en la dirección administrativa
del plantel, un lócker al inicio de cada ciclo escolar, para el efecto de que guarden sus
objetos personales durante las prácticas de laboratorio; en caso contrario, los alumnos
no podrán dejar sus pertenencias en los pasillos, aulas o dentro del laboratorio, y la
institución no se hace responsable de los daños que puedan sufrir.
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V
Síntesis de Fármacos
Artículo 16.-El alumno deberá leer cuidadosamente las etiquetas de los reactivos; en
caso de accidente, deberá actuar con calma y reportar inmediatamente lo sucedido al
docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio.
Artículo 17.- Los alumnos deberán observar los cuidados necesarios para el manejo de
los equipos utilizados en la práctica y leer previamente el instructivo de trabajo, el cual
se encontrará al lado del equipo. Cualquier duda al respecto deberá consultarla con el
encargado y/o técnico del laboratorio y/o docente.
Artículo 25.- Para poder ingresar a los laboratorios, el alumno deberá portar el atuendo
establecido en el presente reglamento, en caso contrario, será facultad del Docente y/o
encargado y/o técnico de laboratorio, restringirle el acceso al mismo; de igual manera,
deberá asistir con puntualidad en las horas programadas para la práctica.
Se nombrará lista de asistencia 10 diez minutos después de la hora señalada para la
práctica, después de lo cual no se permitirá el acceso o salida a ningún alumno; sin
excepción.
Artículo 26.- Se dará una tolerancia de sólo 5 cinco minutos para desocupar las
instalaciones, una vez concluido el horario designado. La ausencia de un docente o
grupo de alumnos en el horario posterior al que le corresponde, no da derecho a seguir
ocupando los laboratorios. Ante la omisión reiterada en el cumplimiento de este artículo
(dos o más veces), se podrá negar una nueva reservación, a criterio del Director
Académico.
Artículo 28.- El docente deberá respetar las fechas y número de prácticas establecidas
por él mismo en el programa de prácticas del laboratorio. Si el docente planea realizar
una práctica diferente a la programada, deberá notificar con preferencia 3 tres días de
anticipación para evitar el gasto innecesario de reactivos y/o uso de equipos. Ante la
omisión reiterada en el cumplimiento de este artículo (dos o más veces), se podrá negar
una nueva reservación, a criterio del Director Académico.
Artículo 29.- El usuario conservará y mantendrá el orden y limpieza de las
instalaciones y equipos de los laboratorios de química. Si el laboratorio se encuentra
sucio antes de empezar la sesión, el usuario deberá reportarlo al encargado y/o técnico
en turno; en caso de no recibir respuesta favorable, se deberá reportar a la Dirección
Académica.
Artículo 30.- Al inicio de cada semestre los alumnos deberán agruparse por equipos o
mesas de laboratorio para realizar las prácticas que les corresponda durante todo el
ciclo escolar, nombrando un representante. El docente y/o encargado y/o técnico de
laboratorio les entregará por equipo o mesa el material que requerirán a lo largo del
semestre, firmando el responsable del equipo, mismo que deberán guardar en la gaveta
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Síntesis de Fármacos
que les corresponda. Al final del semestre, el material deberá ser devuelto íntegro, de lo
contrario le será condicionada la reinscripción al equipo completo.
Existe material que no debe reusarse por la naturaleza de las muestras que se manejan
(como portaobjetos, cubreobjetos), este material deberá desecharse en su contenedor
correspondiente y el alumno deberá reponerlo en la práctica inmediata posterior en que
fue desechado.
Artículo 31.- Al inicio de cada práctica el alumno deberá solicitar al docente y/o
encargado y/o técnico de laboratorio la llave de la gaveta donde se encuentra su
material, para poder emplear el requerido durante la práctica; al final de la misma el
material deberá ser devuelto completamente limpio y seco. En caso de que éste sufra
algún desperfecto, deberá reportarlo al docente y/o encargado del laboratorio, de lo
contrario, asumirá la responsabilidad correspondiente.
Artículo 32.- Por ningún motivo el alumno deberá tratar de abrir o reparar el material o
equipo del laboratorio por sí mismo. Cualquier falla en el equipo o material deberá ser
reportada al docente o técnico y/o encargado del laboratorio.
Artículo 33.- El material y/o equipo utilizado debe ser devuelto en las condiciones que
fue prestado. Por tal motivo, en caso de que el usuario dañe el equipo y/o material a su
cargo de manera accidental o intencional, deberá reponerlo en la práctica inmediata
posterior por uno igual en marca y características. En caso contrario, se le negará el
servicio por tiempo indefinido y se levantará el acta correspondiente, ajeno a la sanción
que le corresponda de acuerdo al Reglamento de Alumnos.
En el caso de docentes y/o técnicos laboratoristas que dañen algún equipo o material,
se valorará el por parte de Coordinación de Laboratorios y la Dirección Académica; en
caso de que tengan que pagar o reponer el material esto se puede hacer mediante un
descuento vía nómina previo Vo. Bo. del departamento de Recursos Humanos.
Artículo 34.- Para el caso de que el laboratorio no cuente con las muestras necesarias
para el desarrollo de la práctica, el docente deberá solicitarlas a sus alumnos con
anticipación.
Artículo 38.- Se debe conservar siempre limpia la mesa de trabajo al inicio, durante y al
finalizar cada práctica; depositar toda la basura en los cestos correspondientes.
Los vertederos deberán estar siempre libres de residuos, no se deberán arrojar cuerpos
sólidos ni papeles.
Artículo 44.- Queda estrictamente prohibido a los usuarios lo siguiente:
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Síntesis de Fármacos
a. Mascar chicle, introducir y consumir bebidas, alimentos, cigarrillos o cualquier
tipo de golosina dentro del área de laboratorios.
b. El uso de lentes oscuros, gorras, audífonos, teléfonos celulares, reproductor de
música o video; videojuegos o cualquier equipo electrónico de entretenimiento o
comunicación no permitido durante el uso de los laboratorios.
c. El uso de sandalias, bermudas, pantalones cortos, cabello largo suelto,
accesorios prominentes y corbata.
d. Ingresar al laboratorio, tanto alumnos como docentes, sin bata de marga larga o
con una bata diferente a la reglamentaria.
e. El desorden y ruidos fuera de lo normal, dentro y fuera de los laboratorios; en
todo caso los usuarios deberán esperar para su ingreso en el perímetro de
acceso a que llegue su docente.
f. La entrada a personas ajenas a la comunidad Universitaria UTEG.
g. Correr, jugar, hacer bromas o acciones que pongan el peligro su seguridad y la
de sus compañeros.
h. Ingresar a los laboratorios si no está presente el docente o encargado de
laboratorio.
i. Utilizar computadora durante la clase, excepto si se requiere para exponer algún
tema.
j. Introducirse objetos en la boca.
k. Hacer uso del equipo de seguridad y/o salida de emergencia cuando no sea
necesario.
l. Mezclar sustancias y reactivos sin la debida autorización del docente o
encargado de laboratorio.
m. Hacer un uso incorrecto del mobiliario, equipos, instalaciones, sustancias o
reactivos de los laboratorios.
n. Proferir palabras altisonantes u ofensivas entre los alumnos, docentes, técnicos
y/o encargados de laboratorio.
o. Las demás que sean establecidas por el docente, encargado y/o técnico o
Director Académico, para garantizar el buen funcionamiento y conservación de
los equipos y laboratorios de química.
Artículo 45.- Ningún alumno podrá permanecer en el recinto de los laboratorios en
ausencia de sus docentes o del responsable de laboratorio, ni portando una bata ajena
a la reglamentaria.
Ningún docente podrá permanecer en los laboratorios fuera de su programa de
prácticas sin la autorización del encargado de laboratorio y/o Director Académico de la
carrera y/o portando bata ajena a la reglamentaria.
Artículo 46.- En caso de incumplimiento a los lineamientos establecidos en el presente
reglamento, podrán ser aplicadas por el encargado o personal responsable del
laboratorio, el docente, el Director Académico y/o Administrativo, según sea el caso, sin
perjuicio de exigir la reparación de los daños ocasionados, las siguientes sanciones:
a. Amonestación verbal o escrita.
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Síntesis de Fármacos
b. Retención de credenciales.
c. Suspensión del servicio.
d. Las sanciones establecidas en el reglamento que por su relación con el Centro
Universitario le correspondan.
Artículo 47.- El alumno debe comportarse adecuadamente dentro de las instalaciones
del laboratorio, hacer uso apropiado del lenguaje oral y escrito, respetar a sus
profesores y compañeros de clase técnicos y/o encargados de laboratorio; en caso
contrario se le suspenderá el servicio temporalmente o en casos graves
indefinidamente, a criterio del docente o del encargado y/o técnico del laboratorio,
previo el aval de Dirección Académica.
Artículo 48.- Los alumnos que incumplan con las disposiciones contenidas en el
presente reglamento, deberán ser reportados por el docente y/o encargado y/o técnico
de laboratorio al Director Académico que corresponda, para que con base en el
Procedimiento de Determinación de Responsabilidad y Aplicación de Sanciones
establecido en el Reglamento de Alumnos, se determine la sanción que le corresponda
de acuerdo a la gravedad de la infracción y se glose copia del acta respectiva al
expediente del alumno.
Artículo 49.- Los docentes y técnicos y/o encargados de laboratorios que incumplan las
obligaciones que este reglamento les confiere, podrán ser sancionados con base en la
gravedad de la infracción, de acuerdo al Reglamento de Docentes o Interior de Trabajo,
según corresponda.
Artículo 50.- Los casos no previstos en este Reglamento serán solucionados por el
encargado o técnico del laboratorio, o por el Director Académico en su caso, atendiendo
a los intereses de la comunidad y teniendo a la vista el cumplimiento de las finalidades
que son propias del servicio de los laboratorios de Química del Centro Universitario.
El presente reglamento fue modificado a petición del Director Académico de la
Licenciatura en Químico Farmacobiólogo durante revisión oficiosa R03/0114 en el mes
de enero de 2014; en virtud de lo anterior se deberá entender que subsiste el contenido
en todas sus partes del presente reglamento, en lo que ve a aquellas disposiciones que
no fueron modificadas. Estas reformas entrarán en vigor a partir del mes de enero de
2014, previa autorización del Director del Macroproceso correspondiente.
TABLA DE MODIFICACIONES
REVISIÓN
FECHA APROBACIÓN
MODIFICACIONES
R02
Enero de 2013
Artículo 4, 8 inciso e) y f) y 18.
R03
Enero de 2014
Art 13, 21 y 23.
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IX
Síntesis de Fármacos
Contenido
Introducción, 1
Práctica Nº 1. Inflamación, 3
Práctica Nº 2. Identificación de linfocitos T. Determinación de rosetas T, 9
Práctica Nº 3. Identificación de linfocitos B, 15
Práctica Nº 4. Hipersensibilidad inmediata, pruebas intradérmicas, 21
Práctica Nº 5. Degranulación de basófilos, 27
Práctica Nº 6. Cuantificación de eosinófilos en secreción nasal, 33
Práctica Nº 7. Determinación de la actividad hemolítica del complemento
por IDR, 37
Práctica Nº 8. Identificación de células LE (lupus eritematoso), 43
Práctica Nº 9. Inmunología del cáncer, 49
Práctica Nº 10. Hipersensibilidad tardía e inmunodeficiencia, 55
Práctica Nº 11. Inmunología de los trasplantes, 61
Bibliografía, 69
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Síntesis de Fármacos
Introducción
La inmunología abarca un amplio campo del conocimiento. Durante los últimos
años, los ensayos de inmunología celular y molecular han cobrado una
importancia significativa, ya que nos brindan abundante información sobre un gran
número de patologías. A la par de esto, se ha desarrollado sinnúmero de técnicas
automatizadas con gran exactitud y precisión; técnicas desarrolladas en
laboratorios de alta especialización. Sin embargo, como en todas las técnicas
novedosas, existe siempre un fundamento o una técnica que podemos efectuar en
laboratorio pequeño o de bajo presupuesto, y no por ello el resultado carecerá de
validez.
Este manual fue diseñado para que el alumno aplique los conocimientos
adquiridos en clase, mismos que forman el fundamento de las técnicas empleadas
en el laboratorio o sirven, a su vez, para la interpretación y correlación de los
resultados.
A lo largo de las prácticas, el alumno desarrollará conocimientos y
habilidades manuales que le permitirán desempeñarse de manera adecuada
dentro del laboratorio de inmunología y, al conocer el fundamento básico de
dichas técnicas, será capaz de comprender lo que sucede dentro de los equipos
automatizados.
Los autores
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Síntesis de Fármacos
Práctica Nº 1
Inflamación
Fundamento
La inflamación es una respuesta compleja de nuestro sistema inmune innato, la
cual refleja los efectos de las citocinas liberadas sobre los tejidos vascularizados.
De manera simple, a una reacción inflamatoria se le puede definir como calor,
rubor, tumefacción, dolor y pérdida de la funcionalidad. Las características
primordiales de una reacción inflamatoria localizada fueron descritas desde hace
casi dos mil años por los romanos y fue en el siglo II DC cuando el médico Galeno
añadió la pérdida de la función al concepto. La inflamación puede ser aguda –
como ejemplo tenemos al daño tisular– o crónica –como consecuencia de una
patología ya establecida–.
El proceso de una reacción inflamatoria es complejo y está dado por una
cascada de eventos que, finalmente, conduce a la migración de células del
sistema inmune hacia el lugar de la lesión. Inmediatamente después de la lesión
tisular, aumenta el diámetro de los vasos sanguíneos (vasodilatación) en dicha
zona, lo que ocasiona un aumento del volumen sanguíneo. Este aumento de
sangre calienta el tejido y lo enrojece. También se aumenta la capilaridad,
permitiendo el escape de líquido desde los vasos sanguíneos y la expansión del
tejido (edema). Pocas horas después los leucocitos se adhieren a las células
endoteliales y atraviesan las paredes de los vasos sanguíneos para migrar a los
espacios tisulares, proceso llamado extravasación. Estos leucocitos se encargan
de fagocitar a los patógenos invasores y liberan mediadores moleculares que
contribuyen a la reacción inflamatoria y al reclutamiento y activación de otras
células del sistema inmune, todo esto tiene como consecuencia la sensación de
dolor y pérdida de la función en la zona lesionada.
Las células del sistema inmune innato desempeñan un papel muy
importante en la respuesta hacia microorganismos invasores. En conjunto, todas
estas células activan una cascada de respuestas cada vez más compleja, para
conseguir la eliminación del agente invasor. Los macrófagos y células NK secretan
citocinas que activan a los macrófagos y estimulan la inflamación, también ayudan
al reclutamiento y activación de leucocitos. Los neutrófilos y los macrófagos
reconocen a los microorganismos por medio de receptores que actúan
estimulando la migración de las células al sitio de la lesión, promoviendo la
fagocitosis y producción de sustancias que eliminan a las bacterias. Los neutrófilos
son las células que migran con mayor rapidez, son las primeras que aparecen en
las zonas de inflamación aguda y predominan durante los primeros días. A partir
del primer día comienzan a migrar fagocitos mononucleares y algunos linfocitos,
por último llegan las células T CD8+ y algunas células B.
Si durante la reacción aguda inflamatoria se logra eliminar el agente
invasor, el tejido comienza a recuperarse de manera normal, pero si no fue posible
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3
Síntesis de Fármacos
eliminar dicho agente, la reacción inflamatoria evolucionará a la cronicidad. En
estos casos las células presentes comienzan a cambiar, escasean los neutrófilos y
se encuentran grandes cantidades de linfocitos T CD4+
y fagocitos
mononucleares. Las reacciones frente a las enfermedades parasitarias suelen
acompañarse de una acumulación de eosinófilos.
El proceso de migración leucocitaria a los sitios de la lesión depende de la
estimulación por citocinas y está mediado por los receptores leucocitarios y por los
ligandos endoteliales de estos receptores. Las citocinas de mayor importancia son
el TNF y las quimiocinas, las cuales son producidas por los macrófagos, las
células endoteliales y otras células en respuesta a la lesión. El TNF estimula a las
células endoteliales para que secuencialmente expresen distintas moléculas que
median la fijación de los leucocitos a la pared del vaso sanguíneo; una o dos horas
después de la exposición al TNF, las células endoteliales expresan selectina E,
que inicia la unión de los neutrófilos y de otros leucocitos a los vasos sanguíneos
en los sitios de inflamación. La molécula de adhesión vascular 1 (V-CAM), el
ligando de la integrina (VLA-4), la molécula de adhesión intracelular (ICAM-1) y los
ligandos de integrinas LFA-1 y Mac-1 aparecen en el endotelio 6 a 12 horas
después de la exposición al TNF. Las integrinas median la fijación estable de los
leucocitos al endotelio, para dar lugar a la posterior migración a través de los
espacios interendoteliales al tejido extravascular donde se encuentre la lesión.
La extravasación de neutrófilos se divide en cuatro pasos:
A) Rodamiento: en presencia de flujo sanguíneo, los leucocitos son impulsados de
tal manera que se desplazan a lo largo de la superficie endotelial.
B) Activación por estímulo quimioatrayente: a medida que el neutrófilo se
desplaza, encuentra quimiocinas producidas en el sitio de la lesión que lo
dirigen.
C) Detención y adhesión: al llegar al sitio de la inflamación, gracias a la
interacción integrinas-ICAM, el neutrófilo estabiliza su adhesión.
D) Migración transendotelial: una vez adherido, el neutrófilo se abre paso a través
de las células endoteliales y migra hacia el tejido dañado.
Objetivo general
¾ Comprender el proceso de una reacción de inflamación.
Objetivo particular
¾ Identificar las células del sistema inmune en respuesta a una lesión
inflamatoria.
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Síntesis de Fármacos
Recursos
•
•
•
•
•
Material
Cubreobjetos.
Portaobjetos.
Pipetas Pasteur.
1 paquetito de algodón.
Cinta microporo.
Reactivos
• Alcohol 90 %.
• Agua desionizada o tampón de
fosfatos, pH 6.8–7.2.
• Colorante Wrigth-Giemsa.
Equipo
N/A
Procedimiento
Parte A. Evaluar la respuesta inflamatoria
Inflamación local:
• Seleccionar a una persona por equipo; con un portaobjeto se le hará una lesión
por raspado en el antebrazo, previamente desinfectado con una torunda con
alcohol.
• Colocar un cubreobjetos sobre la lesión y fijar cuidadosamente con cinta
microporo.
• El cubreobjetos se cambiará a las 2, 6, 12, 24 y 48 horas, marcando cada uno
de ellos y teniendo extremo cuidado de no romperlos.
• Guardar los cubreobjetos cuidadosamente y marcar la hora que corresponde a
cada uno, llevarlos a la siguiente práctica para efectuar la segunda parte.
Parte B. Observación de las células participantes en la reacción inflamatoria
Esta parte consiste en teñir los cubreobjetos con el colorante Wrigth-Giemsa y así
observar al microscopio las células que se encuentran a las diferentes horas.
Tinción de Wrigth-Giemsa:
• Colocar los cubreobjetos completamente secos en una gradilla de tinción.
• Cubrir el cubreobjetos con colorante de Wright-Giemsa.
• Tras 1 minuto, añadir un volumen igual de agua desionizada o tampón de
fosfatos pH 6.8–7.2 y mezclar bien, soplando con cuidado sobre el
cubreobjetos, sin derramar el colorante.
• Tras 1-3 minutos, lavar con agua desionizada y secar al aire.
Observar al microscopio:
• Identificar en el microscopio las diferentes líneas celulares reclutadas en el sitio
de la lesión en los diferentes tiempos, con los objetivos 10X y 40X.
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Síntesis de Fármacos
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Qué es la inflamación?
2. Mencione las características principales de la inflamación.
3. Mencione los tipos de inflamación y un ejemplo de cada uno de ellos.
4. ¿Cuáles son las primeras células en aparecer en una reacción inflamatoria
aguda?
5. ¿Qué son las citocinas y cuál es su función en el proceso de inflamación?
6. ¿Cuáles son las citocinas más importantes en una reacción inflamatoria?
7. ¿Cuáles son las moléculas que median la fijación estable de los leucocitos al
endotelio vascular?
8. Mencione y explique brevemente los pasos de la extravasación de neutrófilos.
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Síntesis de Fármacos
B) Diagrama de flujo de la reacción de inflamación.
Resultados
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Observaciones
Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
Página Editorial
1.
2.
3.
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
8
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Práctica Nº 2
Identificación de linfocitos T. Determinación de rosetas T
Fundamento
Los linfocitos son las únicas células del cuerpo capaces de reconocer los diversos
antígenos y distinguirlos específicamente, lo que da a la respuesta inmunitaria
adaptativa sus dos características principales: la especificidad y la memoria. Los
linfocitos constan de distintos subconjuntos que difieren en su función y productos
proteínicos, pero son morfológicamente muy parecidos.
Las poblaciones y subpoblaciones de linfocitos tienen características
morfológicas similares. Para identificarlas son necesarios métodos de laboratorio
que detectan proteínas de membrana denominadas ‘marcadores’. Alrededor de
1970, Brain demostró que los linfocitos T humanos poseen la propiedad de unirse
espontáneamente a los eritrocitos de carnero in vitro, formando agrupaciones
denominadas ‘rosetas E’. Esta propiedad ha sido útil en el desarrollo una técnica
sencilla y de bajo costo para la cuantificación de los linfocitos T.
La formación de las rosetas se debe a que los linfocitos T humanos poseen
en su superficie un receptor que provoca su unión con los eritrocitos de carnero.
Este receptor se conoce como CD2 y forma parte de una familia, los
llamados ‘CD’ (de clusters of differentiation); como tal es una glicoproteína de
membrana de 50 kDa presente en los linfocitos T maduros, su función es
interactuar con una glicoproteína de 40-70 kDa llamada LFA-3 (leukocyte function
antigen) o CD58, presente en la superficie de diversos tipos celulares. Por su
parte, los eritrocitos de carnero poseen una molécula similar al LFA-3 humano en
su superficie. El receptor CD2 cumple la función de estabilizar las interacciones
celulares durante la adhesión y la activación de los linfocitos T.
La presencia del CD2 es útil para identificar a los linfocitos T humanos,
mediante la formación de rosetas. Este método ha sido paulatinamente sustituido
por métodos de inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales,
especialmente con citometría de flujo. Sin embargo, dado su bajo costo, el método
de rosetas E sigue siendo una alternativa válida y útil para los laboratorios
pequeños o de bajo presupuesto.
Objetivo general
¾ Analizar la participación de los linfocitos T en la respuesta inmune y aprender
los métodos empleados para la identificación de los mismos.
Objetivo particular
¾ Identificar a los linfocitos B utilizando el método de rosetas E.
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Síntesis de Fármacos
Recursos
Material
• 4 tubos de 13 x 100.
• 4 tubos de 12 x 75.
• 1 tubo con tapón de baquelita.
• 1 pipeta de 5 ml.
• 1 torniquete.
• 2 pipetas Pasteur.
• 1 portaobjetos y cubreobjetos.
• 1 jeringa de 5 ml.
• Algodón.
• 1 pipeta de 1 ml.
• Perlas de vidrio.
Reactivos
• Solución Linfocell o
Linfoprep.
• Eritrocitos de
carnero al 2 %.
• Solución de Hanks.
• Alcohol.
Equipo
• Centrifuga clínica.
Procedimiento
Parte A. Preparación del método
Preparación de células indicadoras:
1. Obtener 5 ml de sangre periférica de carnero en condiciones asépticas, en
tubos con anticoagulante. La muestra puede ser almacenada en refrigeración
hasta por 4 semanas.
2. Lavar 3 veces los eritrocitos con SSF, centrifugando a 2,000 rpm durante
7 minutos cada vez.
3. Resuspender el botón eritrocitario en 1 ml de TBE.
4. Hacer una dilución al 6 % de eritrocitos (llevando el ml de eritrocitos a un
volumen final de 17.5 ml).
Procedimiento de rosetas:
1. Tomar de 3 a 5 ml de sangre y desfibrinar.
2. Agregar 2 ml de solución de Hanks a 2 ml de sangre desfibrinada.
3. Tomar 1 ml de esta disolución y agregárselo a 2 ml de Linfoprep. Centrifugar a
1,000 rpm durante 15 minutos para separación de linfocitos.
4. Con una pipeta Pasteur, tomar los linfocitos y pasarlos a un tubo 12 x 75 y
lavar con 2 ml de solución de Hanks. Centrifugar a 3,000 rpm durante
5 minutos.
5. Observar el anillo que se forma en el fondo del tubo, son los linfocitos. Eliminar
con mucho cuidado la solución de Hanks con una pipeta Pasteur haata dejar
+/- 0.25 ml.
6. Agitar suavemente y con una pipeta Pasteur colocar una gota en un
portaobjetos, para observar al microscopio si hay leucocitos.
7. Aparte preparar una solución de eritrocitos de carnero al 1 %.
8. Del paso 6, quedan 0.25 ml de linfocitos en Hanks. Añadir 0.25 ml de E. de C.
al 1 %. Centrifugar a 500 rpm.
10
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Síntesis de Fármacos
9. Incubar a 37 °C durante 15 minutos.
10. Con mucho cuidado se suspende el paquete celular. Se toma una gota con una
pipeta Pasteur y se coloca en porta y cubreobjetos.
Parte B. Examen de rosetas
1. Se observan al microscopio utilizando el objetivo seco fuerte.
2. Se cuentan 100 linfocitos y se toman como rosetas aquellos que tengan 3 o
más eritrocitos adheridos a su superficie.
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Cuál es la función característica de los linfocitos T?
2. Mencione otros métodos de identificación de linfocitos T.
3. ¿Qué característica permite la formación de rosetas de linfocitos T?
4. Explique por qué razón se utilizan eritrocitos de carnero y no eritrocitos
humanos.
5. ¿En qué órgano ocurre el proceso de maduración de linfocitos T?
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11
Síntesis de Fármacos
B) Diagrama de flujo del método de rosetas EAC.
Resultados
12
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Síntesis de Fármacos
Observaciones
Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
Página Editorial
1.
2.
3.
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
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13
Síntesis de Fármacos
Práctica Nº 3
Identificación de linfocitos B
Fundamento
Los linfocitos B son las células productoras de anticuerpos (inmunidad humoral),
sus primeras fases de maduración transcurren en la médula ósea (en inglés, bone
marrow), de donde adquirieron su nombre.
Cuantificación de linfocitos B
La mayoría de los linfocitos reside en los órganos linfáticos, razón por la cual es
difícil su cuantificación exacta en los tejidos periféricos. Los linfocitos B se
distinguen por la síntesis de inmunoglobulinas de superficie, mismas que portan
en el exterior; éstas deben ser diferenciadas de las inmunoglobulinas absorbidas;
estas células también pueden ser detectadas por la presencia de receptores Fc y
un receptor para el tercer componente del complemento (C3). De 10 a 25 % de los
linfocitos circulantes porta estos marcadores. Es importante que las células B sean
enumeradas tanto en porcentaje como en números absolutos.
Se encuentran problemas técnicos con todos los métodos de identificación
de marcadores usados; las inmunoglobulinas de superficie membranal (IgS) son
las más específicas, pero son las que presentan más problemas, puesto que dan
resultados falsos positivos gracias a que los complejos y los agregados en las
pruebas de antisueros se unen a receptores Fc. Es posible usar una amplia gama
de antisueros específicos para identificar las diferentes clases y subclases de
inmunoglobulinas.
Los Fc y C3 de los linfocitos pueden ser detectados por los métodos de
rosetas con células rojas tratadas adecuadamente, sin embargo, los monocitos
también presentan esta característica, por lo que es necesario identificar a los
monocitos por su capacidad de fagocitar partículas de látex, o eliminarlos
mediante la adherencia con plástico/nylon. Ninguno de estos métodos es
completamente confiable, ya que no todos los monocitos pueden ser fagocitos y
algunas células B pueden ser eliminadas por dichos métodos de adherencia.
Identificación de los linfocitos B
El porcentaje de linfocitos B portadores de diferentes clases de IgS en personas
normales, tiene poca relación con el nivel sérico de la mismas inmunoglobulinas.
En algunas inmunodeficiencias estos niveles no guardan relación, como en la
agammaglobulinemia de Bruton, donde los niveles de IgS están bajos e incluso
ausentes. En cambio, en la hipogammaglobulinemia, los niveles séricos se
encuentran normales. Otro ejemplo son los pacientes con deficiencia aislada de
IgA, quienes tienen una población normal de linfocitos circulantes con IgA.
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15
Síntesis de Fármacos
Métodos para determinar la cantidad de células B
Uno de los métodos utilizados se basa en que los linfocitos B tienen receptores de
membrana para C3, gracias a esto tienen la capacidad de formar rosetas con las
células rojas cubiertas de complemento. Las células rojas que se utilizan son
eritrocitos de carnero (E) tratados con anticuerpos de eritrocito (A) y complemento
humano (C). Otro método de identificación consiste en el uso de anticuerpos
antiinmunoglobulina, los cuales pueden ser marcados con cromóforos como la
fluoresceína (método directo o método de anticuerpo primario), o pueden no estar
marcados y depender del uso de un segundo anticuerpo marcado en contra del
primero (método indirecto o método de anticuerpo secundario).
Objetivo general
¾ Analizar la participación de los linfocitos B en la respuesta inmune y aprender
los métodos empleados para la identificación de los mismos.
Objetivo particular
¾ Identificar a los linfocitos B utilizando el método de rosetas EAC.
Recursos
Material
• Tubos de ensayo
10 x 75 mm.
Reactivos
• Eritrocitos de carnero (en solución de
Alsever al 50 %).
• Suero con IgM antieritrocito de carnero.
• Suero fresco humano congelado (frío) AB.
• Colorante May-Grunwald-Giemsa.
• Solución Linfocell o Linfoprep.
Equipo
• Centrifuga
clínica.
Procedimiento
Parte A. Preparación del método
Preparación de células indicadoras:
• Lavar 3 veces 0.5 ml de eritrocitos con solución salina, al final suspenderlos en
5 ml de solución salina.
• Añadir 0.1 ml de suero de conejo con IgM antieritrocito de carnero a dosis de
subhematoglutinación e incubar a 37 °C por 20 minutos. agitando la muestra.
• Lavar 3 veces en solución salina y resuspender en 10 ml de solución salina.
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Síntesis de Fármacos
•
•
Añadir 0.3 ml de suero fresco humano congelado AB como fuente de
complemento e incubar a 37 °C por 20 minutos, mezclando repetidamente.
Lavar 3 veces en solución salina y resuspender en 5 ml de solución salina
(solución EAC).
Nota: la suspensión debe estar fresca y preparada para el día de la prueba; si ya
pasó más de una hora entre la preparación y su uso, lavar una vez más en
solución salina.
Preparación de linfocitos:
• Se obtienen 5 ml de sangre venosa de un voluntario con la jeringa
heparinizada; se mezcla bien por inversión.
• Con la misma jeringa se toman 5 ml de SSA y se mezcla bien por inversión.
• De la sangre diluida, se estratifican 4 ml sobre 2.5 ml de la solución Linfoprep
contenida en un tubo de ensayo.
• Se centrifuga a 1,500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente
(centrifuga clínica).
• En la interfase entre Linfoprep y el plasma diluido quedan los linfocitos, los
cuales se recuperan con una pipeta Pasteur.
• Se transfieren las células a un tubo de ensayo y se lavan por centrifugación
tres veces con SSA a 1,500 rpm durante 4 minutos (centrífuga clínica).
• Las células recuperadas se cuentan y se ajustan a una concentración de
4 x 106 linfocitos/ml utilizando pipetas Thomas para leucocitos.
Procedimiento de rosetas:
• Añadir 8 a 10 gotas de suspensión de EAC (radio 8:1) a 0.5 ml de suspensión
de linfocitos (aprox. 2 x 106 / ml).
• Mezclar la suspensión y sedimentar por centrifugación gentil a 25 g por
5 minutos.
• Incubar a 37 °C por 40 minutos.
• Resuspender por aspiración hasta eliminar los grumos.
• Con mucho cuidado se suspende el paquete celular. Se toma una gota con
una pipeta Pasteur y se coloca en porta y cubreobjetos.
Parte B. Examen de rosetas
Se debe tener cuidado al observar, ya que los polimorfismos y los monocitos
también pueden formar rosetas EAC. Para identificar adecuadamente las
rosetas B EAC se toma en cuenta que éstas son más pequeñas y tienen una capa
de células rojas adherentes. Para excluir esta formación de rosetas debido a los
receptores Fc de otras células, se utiliza una fracción IgM de suero antieritrocítico.
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17
Síntesis de Fármacos
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Cuál es la característica principal de los linfocitos?
2. Mencione la función de los linfocitos B y en dónde transcurren sus primeras
fases de maduración.
3. ¿A qué tipo de respuesta inmunitaria pertenece la activación de linfocitos B
(producción de anticuerpos)?
4. Mencione la razón por la cual es difícil la cuantificación exacta de los linfocitos
en los tejidos periféricos.
5. ¿Qué características presentan los linfocitos B que permiten su diferenciación
de otras células del sistema inmune?
6. Mencione los métodos empleados en el laboratorio para identificar linfocitos B.
7. ¿Qué características permiten identificar y diferenciar a los monocitos?
8. Mencione la diferencia entre el método directo y el indirecto para la
identificación de linfocitos B.
18
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Síntesis de Fármacos
B) Diagrama de flujo del método de rosetas EAC.
Resultados
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19
Síntesis de Fármacos
Observaciones
Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
Página Editorial
1.
2.
3.
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
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Síntesis de Fármacos
Práctica Nº 4
Hipersensibilidad inmediata. Pruebas intradérmicas
Fundamento
La reacción de hipersensibilidad inmediata se conoce de esta forma debido a su
rápida aparición, la cual ocurre inmediatamente después del contacto con el
antígeno y ocasiona consecuencias patológicas importantes (hipersensibilidad).
Las respuestas inmunitarias a los antígenos ambientales dan lugar a la
diferenciación de los linfocitos TH2 CD4+ y a la síntesis de anticuerpos de la
clase IgE, que se unen a los receptores Fc de los mastocitos y basófilos. Cuando
el anticuerpo se entrecruza con el antígeno, estas células se activan y liberan
rápidamente diversos mediadores, como histaminas y leucotrienos, entre otros,
que provocan un aumento de la permeabilidad vascular, vasodilatación,
contracción del músculo liso bronquial y visceral, e inflamación local, lo que
comprende una reacción de hipersensibilidad inmediata. Si esto ocurre en la piel,
se manifiesta a manera de habones o ronchas circunscritas y un área de edema,
rodeada de inflamación. En la práctica clínica, estas reacciones se conocen como
‘alergias’ o ‘atopias’.
La reproducción de una reacción de hipersensibilidad inmediata se logra
mediante la aplicación directa de pequeñas cantidades de extractos alergénicos
sospechosos dentro de la piel; esto es de gran ayuda diagnóstica en medicina.
Las pruebas intradérmicas se han utilizado con gran éxito para la detección de
pacientes alérgicos que presentan signos y síntomas característicos, ya que en
manos expertas proporcionan un parámetro de gran confianza diagnóstica y
terapéutica. Una de sus ventajas es que pueden aplicarse en poco tiempo y
representan un mínimo riesgo para el paciente.
Las técnicas para el diagnóstico de alergias comprenden dos grupos,
aquellas que se efectúan directamente en las personas (in vivo) y aquellas que se
efectúan en el laboratorio (in vitro); todas han sido probadas y estudiadas
ampliamente para saber su especificidad, sensibilidad y positividad predictiva, por
lo que son muy confiables.
Las pruebas in vivo incluyen las pruebas intradérmicas con alergenos y las
pruebas de exposición directa con sustancias alergénicas (método de Prick); de
estas dos pruebas, las intradérmicas son las preferidas, por su especificidad,
predictividad y facilidad de aplicación. Las pruebas intradérmicas tienen varias
ventajas, entre las cuales se encuentran la rapidez con la que son efectuadas, la
simplicidad, el bajo costo y su alta sensibilidad. Gracias a estas pruebas se puede
identificar el agente productor de alergia, como polen, hongos, pelos, caspa de
animales, etcétera; se aplican preferentemente en los brazos, en sesiones de
varios días, durante las cuales se utilizan antígenos a diferentes concentraciones
en series progresivas.
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21
Síntesis de Fármacos
Entre las pruebas cutáneas tenemos tres alternativas: la estimación directa
de niveles séricos de IgE, la eliminación de histamina de leucocitos periféricos, y el
RAST (radioalergeno-absorbencia). Los últimos dos métodos son más exactos
pero menos sensibles, debido a esto no se prefieren. Las indicaciones clínicas
para efctuar estas pruebas se hacen ante cualquier sospecha clínica de que un
signo o síntoma sea resultado de una alergia. Esta decisión debe tomarla el
médico, basándose en la observación y en la historia de exposición a alergenos
conocidos.
Objetivos generales
¾ Conocer las características principales de las reacciones de hipersensibilidad
inmediata.
¾ Aprender a ejecutar pruebas intradérmicas de hipersensibilidad inmediata.
Objetivos particulares
¾ Conocer los elementos participantes en la reacción de hipersensibilidad
inmediata.
¾ Entender el mecanismo fisiopatológico de las reacciones de hipersensibilidad
inmediata.
¾ Entender los principios de diagnóstico inmunológico en las enfermedades
alérgicas.
Recursos
Material
• Jeringas
hipodérmicas para
insulina.
• Algodón.
Reactivos
• Diferentes alergenos diluidos en soluciones
de Evans, a concentraciones de 1:1,000 y
1:10,000.
• Antígenos de polvo, gato, perro, algodón,
tabaco, ganado, ácaro, pólenes y hongos.
• Alcohol 90 %.
Equipo
N/A
Procedimiento
Nota: estas pruebas deben ejecutarse con cuidado, debido a las reacciones
alérgicas generalizadas que, aunque raramente, se pueden presentar y ser
fatales. En caso de una reacción anafiláctica, se debe poner un torniquete arriba
del sitio de la prueba e inyectar 0.1 cc de adrenalina acuosa 1:1,000, la cual debe
estar siempre a la mano.
22
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Síntesis de Fármacos
1. Tomar una jeringa estéril desechable de 1 ml de tuberculina con aguja de
26 x 12 (1 cm) y llenarla con 0.1 ml de solución a probar; cuidar que la jeringa
no tenga burbujas.
2. Limpiar muy bien con alcohol la zona de la piel en donde se aplicará la prueba
(preferentemente en el brazo).
3. Los sitios de aplicación se marcan apropiadamente para distinguir cada
sustancia; deben estar separados al menos 7.6 cm uno de otro para prevenir
solapamiento de las reacciones.
4. Aplicar la solución intradérmicamente; si se usa el brazo la piel debe jalarse por
detrás, colocar la jeringa en ángulo de 45 ° con el bisel hacia abajo, introducir
la aguja y lentamente depositar la sustancia.
5. Se utilizará un control con histamina para verificar la calidad de la técnica, con
la solución base de histamina al 0.01% con 0.275 mg de fosfato de histamina
(Eli Lily & Co. Indianapolis) por ml de diluyente (11.5 mm de roncha con +2.1 mm).
6. Hacer la lectura 15 minutos después, reportar si hay formación de pápula o
eritema inmediato o tardío, guiándose con la siguiente tabla:
Grado Tamaño del eritema (mm) Tamaño de la roncha (mm)
0
<5
<4
+-
5-10
5-10
1+
11-20
5-10
2+
21-30
5-10
3+
31-40
10-15 (con pseudópodos)
4+
>40
>15 (con pseudópodos)
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Qué otros nombres reciben las reacciones de hipersensibilidad inmediata?
2. ¿Cuál es la inmunoglobulina que se encuentra en las reacciones de
hipersensibilidad inmediata?
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23
Síntesis de Fármacos
3. Mencione brevemente la fisiopatología de las reacciones de hipersensibilidad
inmediata.
4. ¿De qué manera se logra la reproducción de una reacción de hipersensibilidad
inmediata en un paciente?
5. ¿En qué consiste el método de Prick?
6. ¿Cuáles son los métodos que se pueden utilizar para pruebas cutáneas y cuál
se prefiere?
7. Mencione al menos tres ventajas de las pruebas intradérmicas.
B) Diagrama de flujo de las pruebas intradérmicas
24
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Síntesis de Fármacos
Resultados
Observaciones
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25
Síntesis de Fármacos
Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
Página Editorial
1.
2.
3.
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
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Síntesis de Fármacos
Práctica Nº 5
Degranulación de basófilos
Fundamento
Los mastocitos, los basófilos y los eosinófilos son las células efectoras de las
reacciones de hipersensibilidad inmediata o de tipo I y, por lo tanto, de la
enfermedad alérgica. Aunque cada una de estas células tiene sus propias
características, las tres tienen gránulos citoplásmicos que contienen mediadores
importantes de las reacciones alérgicas y las tres sintetizan mediadores lipídicos y
citocinas que desencadenan la inflamación. Los basófilos son granulocitos
sanguíneos que derivan de progenitores existentes en la médula ósea, maduran
en la misma y circulan en la sangre. Estas células representan menos de 1 % de
los leucocitos y sus gránulos se tiñen con colorantes básicos.
Las alergias a los medicamentos representan un problema frecuente, por lo
que su prevención, reconocimiento y diagnóstico temprano son muy importantes.
Las pruebas cutáneas son de gran ayuda, aunque sólo muestran si la piel del
paciente es hipersensible a la droga, pero no indican que ésta sea capaz de
provocar una respuesta sistémica. Por esta razón, la prueba confirmatoria es la
degranulación de basófilos, la cual valora la hipersensibilidad que se presenta ante
dicha droga en un sistema in vitro, mediante la observación de la respuesta
biomorfológica del basófilo ante la droga.
Ya que esta prueba es efectuada in vitro, es completamente segura para el
paciente. La degranulación de basófilos también es útil para diagnosticar la
hipersensibilidad a insectos o a su veneno, como es el caso de las personas
sensibles al veneno de abeja; o puede ser sólo un criterio de hipersensibilidad
inmediata en situaciones no alérgicas.
Esta prueba se originó en 1958 gracias a Shilley, quien observó un choque
anafiláctico en un paciente alérgico a la penicilina. Shilley encontró que los
basófilos son un índice citológico útil para medir la anafilaxia y efectuó estudios en
diferentes especies de animales; finalmente concluyó que al colocar los basófilos
de conejo (similares a los de humano) en el suero de pacientes sensibles a la
penicilina y añadir la misma, los basófilos presentaban degranulación, lo cual no
ocurría con el suero de personas no sensibles a la penicilina.
Otros estudios han demostrado que la degranulación de basófilos también
es útil como indicador de la reacción antígeno-anticuerpo y que ésta varía en
proporción a las cantidades del antígeno, por esta razón se cree que el sistema de
células cebadas-basófilo tiene respuestas paralelas y ambas células liberan el
complejo histamina-heparina en una reacción alérgica. Esto explica que los
esteroides y los antihistamínicos puedan inhibir el fenómeno de la degranulación.
La degranulación de basófilos es tiempo-dependiente, esto es, puede ser
negativa una o dos semanas después del choque anafiláctico, debido a la
depleción de anticuerpos. Puede ser alterada por varios factores como la lipemia
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27
Síntesis de Fármacos
(la ingesta de 4 mg/kg de margarina y niveles séricos de 8 mEq/L de triglicéridos),
la cual puede causar la degranulación en 75 % de las veces, sin embargo, no hay
correlación entre el nivel de lipemia y el porcentaje de degranulación.
Objetivos generales
¾ Conocer la participación de los basófilos en la respuesta inmune tipo I.
¾ Aprender la técnica de degranulación de basófilos.
Objetivos particulares
¾ Revisar el proceso fisiopatológico de la respuesta inmune tipo I.
¾ Efectuar la técnica de degranulación de basófilos.
Recursos
Material
• 15 tubos de
ensayo de
10 x 75 ml.
• 3 pipetas Pasteur
con bulbo.
• 2 pipetas
graduadas de 1 ml.
• 1 pipeta graduada
de 5 ml.
• Portaobjetos.
Reactivos y muestras
• 2 ml de sangre heparinizada de una
persona alérgica a un medicamento
(especificar a cuál).
• El medicamento al cual es alérgica.
• 2 ml de sangre heparinizada de una
persona sana como control
negativo.
• 2 ml de sangre heparinizada de una
persona alérgica al veneno de abeja
como control positivo.
• Linfoprep.
• Solución salina 0.95 %.
• Colorante rojo neutro.
• Colorante azul de toluidina.
Equipo
• Centrífuga.
• Estufa a 37° C.
• Microscopio.
Procedimiento
1. Una vez tomadas las muestras entre los 120 días posteriores a la ingesta de la
droga reactante, se efectúa el método de aislamiento de células
mononucleares, de la misma manera que en la técnica de determinación de
rosetas de linfocitos B.
2. Obtener un paquete de células blancas (basófilos) mediante la centrifugación y
purificación con linfoprep de los 2 ml de sangre heparinizada de cada paciente.
28
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Síntesis de Fármacos
3. Preparar diluciones de la droga reactante a concentraciones de 1:100, 1:1,000
y 1:2,000, diluirlas con solución salina fisiológica al 0.95 %.
4. Poner en contacto las células rojas con las diferentes diluciones.
5. Añadir 2 gotas de rojo neutro e incubar a 37 °C por 20 minutos.
6. Hacer un frotis de células y dejar secar, posteriormente teñir con azul de
toluidina.
7. Usar las células blancas del individuo sano y las del individuo alérgico al
veneno de abeja como controles.
8. Se observa al microscopio y se cuentan 1,000 células así como los basófilos
que se encuentren entre ellas, para comparar el número de basófilos de las
muestras control con la muestra problema.
9. La muestra será positiva si presenta 2 o más degranulaciones mayores al 20 %
respecto de la muestra control.
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Cuáles son las células efectoras de las reacciones de hipersensibilidad
inmediata o de tipo I?
2. Describa los basófilos.
3. Describa brevemente la fisiopatología de la degranulación de basófilos.
4. ¿Por qué no es suficiente una prueba cutánea para diagnosticar alergia a los
medicamentos?
5. ¿Cuál es la prueba confirmatoria de alergia a algún medicamento?
6. ¿Qué medicamentos se pueden utilizar para inhibir el fenómeno de la
degranulación?
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29
Síntesis de Fármacos
7. ¿Qué factores pueden alterar la degranulación de basófilos?
B) Diagrama de flujo de la degranulación de basófilos
Resultados
30
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Síntesis de Fármacos
Observaciones
Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
Página Editorial
1.
2.
3.
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
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31
Síntesis de Fármacos
Práctica Nº 6
Cuantificación de eosinófilos en secreción nasal
Fundamento
Los eosinófilos son granulocitos procedentes de la médula ósea, ahí maduran y
posteriormente circulan en la sangre. Sus gránulos contienen proteínas básicas
que se unen a los colorantes básicos como la eosina; estas células se presentan
abundantemente en los infiltrados inflamatorios de las reacciones tardías y
contribuyen a muchos de los procesos patológicos de las enfermedades alérgicas.
Las citocinas producidas por los linfocitos TH2 activan a los eosinófilos y los atraen
hacia los focos de inflamación en fase tardía; la IL-5 es una citocina que estimula
la maduración de los eosinófilos, también es activadora de los mismos y mejora su
capacidad para liberar el contenido de los gránulos, el cual contiene proteínas
tóxicas para los parásitos y que pueden dañar también los tejidos normales.
En los procesos inflamatorios que tienen como factor desencadenante un
parásito o procesos alérgicos, se encuentra infiltración de eosinófilos. Se sugiere
que éstos cumplen un papel de fagocitosis de complejos inmunes y desactivación
de la histamina liberada de los tejidos por los mastocitos. Los eosinófilos tienen
dos tipos de gránulos, unos pequeños de tipo lisosomas dotados de fosfatasa
alcalina, y otros de mayor tamaño dotados de arginina y cristales de CharcotLeyden.
La eosinofilia es característica de los procesos atópicos, y puede aumentar
si aumenta el contacto con el alérgeno. La eosinofilia es favorecida por la
liberación del factor quimiotáctico eosinofílico (FQE) de las células cebadas
degranuladas; debido a esto una persona atópica puede presentar eosinofilia en
sangre periférica y en moco nasal, o puede que la presente en uno y en el otro
esté normal.
Objetivo general
¾ Identificar a los eosinófilos en la secreción nasal.
Objetivos particulares
¾ Valorar la respuesta celular en la secreción nasal.
¾ Ejecutar la técnica de tinción de eosinófilos.
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33
Síntesis de Fármacos
Recursos
Material
• Portaobjetos.
• Hisopos estériles.
Reactivos y muestras
• Colorante de Wrigth.
• Mucosa nasal.
Equipo
• Microscopio.
Procedimiento
1. Tomar una muestra de secreción de la mucosa nasal con un hisopo estéril, se
debe hacer de forma giratoria.
2. Correr suavemente la muestra sobre el portaobjetos.
3. Dejar secar a temperatura ambiente.
4. Teñir con la técnica de Wrigth
5. Observar al microscopio la presencia de eosinófilos y sus características; usar
aceite de inmersión.
6. Los resultados se interpretan de la siguiente manera:
a. Más de 10 % de eosinófilos en personas atópicas.
b. 0 % de eosinófilos en personas no atópicas.
Actividades
A) Cuestionario
1. Describa los eosinófilos.
2. ¿En dónde podemos encontrar infiltrados de eosinófilos?
3. ¿Cuál es la citocina que estimula la maduración de los eosinófilos y los activa
para que liberen el contenido de sus gránulos?
4. ¿Cuáles son los tipos de gránulos que encontramos en los eosinófilos y qué
contienen?
5. Mencione los valores normales de eosinófilos en la secreción nasal en
personas atópicas y no atópicas.
34
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Síntesis de Fármacos
B) Diagrama de flujo de la cuantificación de eosinófilos en la secreción nasal
Resultados
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35
Síntesis de Fármacos
Observaciones
Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
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1.
2.
3.
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
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Síntesis de Fármacos
Práctica Nº 7
Determinación de la actividad
hemolítica del complemento por IDR
Fundamento
El sistema del complemento está constituido por un conjunto de glicoproteínas
plasmáticas presentes en el organismo a manera de zimógenos, las cuales tienen
la capacidad de ser activadas frente a estímulos de diferente naturaleza.
La activación de este sistema ocurre de forma secuencial; es denominado
‘sistema en cascada’ y forma parte importante de los mecanismos inespecíficos de
la inmunidad en vertebrados, participando principalmente en actividades como la
promoción de la inflamación y de la fagocitosis, el ataque lítico hacia membranas y
la facilitación de la remoción de complejos inmunes.
Dependiendo qué estímulo es el responsable de activar la cascada, puede
ser clasificado dentro de alguna de las siguientes vías:
-
-
-
Vía clásica: iniciada por el reconocimiento de los complejos antígenoanticuerpo, principalmente los de origen IgM, IgG1 e IgG3. Para su activación
es indispensable la presencia de iones Ca++ y Mg++. El orden de activación de
los
componentes
en
esta
vía
es
el
siguiente:
Ag-Ac→C1→C4→C2→C3→C5→C6→C7→C8→C9.
Las
consecuencias
biológicas de su activación incluyen el aumento de la permeabilidad vascular,
la quimiotaxis de polimorfonucleares, la adherencia celular, etcétera.
Vía alterna: es la vía filogenéticamente más antigua, iniciada por la detección
de polímeros de superficie de origen bacteriano o vírico (ej. polisacáridos). En
esta vía no participan los factores C1, C4 y C2; en su lugar encontramos los
factores D, C3, B C3b y P. El orden de activación es el siguiente:
polisacárido→C3→C3b→D→B→P→C3→C5→C6→C7→C8→C9.
Vía de las lectinas: se inicia por lectinas que reconocen residuos de manosa en
las superficies microbianas, como la MBL (mannose-binding lectin).
Todas estas vías de activación conducen a una fase efectora común, que culmina
con el ataque lítico a membranas.
La medición y monitoreo del complemento tiene el objeto de detectar y
cuantificar el grado de producción y consumo del complemento, y con ello
diagnosticar las deficiencias del mismo, ya sean de tipo genético o provocadas por
algún factor secundario.
Algunas alteraciones de importancia clínica del complemento son: en
inmunodeficiencias, existen defectos en este sistema, los cuales por lo general
consisten en la ausencia o la falta de funcionalidad de alguno de los factores de la
cascada, generalmente por causas genéticas.
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37
Síntesis de Fármacos
En las enfermedades autoinmunes, las proteínas del complemento juegan
un papel importante en la lesión a los tejidos, determinación puede orientar el
diagnóstico, evaluar el curso y actividad de la enfermedad y dar una idea de la
severidad del daño.
Algunas patologías donde podemos encontrar de cambios en los niveles del
complemento, son:
-
-
Patologías que aumentan los niveles de complemento: síndrome de Reiter,
ictericia obstructiva, gota, diabetes, tiroiditis, artritis reumatoide, fiebre
reumática aguda, fiebre tifoidea, periarteritis nodosa, colitis ulcerativa,
dermatomiositis e Infarto agudo al miocardio.
Patologías que disminuyen los niveles de complemento: Lupus eritematoso
sistémico, enfermedad del suero, cirrosis hepática avanzada, hepatitis
infecciosa con artritis, edema angioneurótico hereditario, deficiencia hereditaria
de C2, hemoglobinuria paroxística nocturna, coagulación intravascular
diseminada,
inmunodeficiencia
combinada
grave,
glomerulonefritis
membranoproliferativa, glomerulonefritis aguda, enfermedades por complejos
inmunes, linfoma, rechazo de aloinjertos, crioglobulinemia mixta (IgG-IgM),
endocarditis infecciosa con glomerulonefritis, miastenia gravis y derivaciones
ventriculoarteriales infectadas.
Metodología para la determinación de complemento
La determinación del sistema del complemento presenta algunas dificultades,
dada la complejidad propia de la cascada, la labilidad de sus componentes y su
inhibición por factores reguladores. Estos factores limitantes dificultan la
reproducibilidad de muchas de las técnicas.
Las principales técnicas empleadas para determinar el complemento
pueden dividirse en dos conjuntos generales: las pruebas funcionales y las
inmunoquímicas. Cada conjunto posee diversas virtudes y limitaciones, por lo que
generalmente se emplean en combinación para obtener mejores resultados.
La cuantificación de los componentes mayoritarios (C3, C4 y Cq) puede
hacerse mediante técnicas como inmunodifusión radial o inmunonefelometría. La
principal limitante de esta técnica es su capacidad de detectar tanto componentes
funcionales normales, como aquellos sin función (mutados, inactivados etcétera).
Por ejemplo, algunos antisueros empleados en placas de inmunodifusión radial
pueden reaccionar con fragmentos de degradación de los componentes nativos, lo
cual puede originar valores falsos positivos.
De la misma manera, se han desarrollado métodos para la cuantificación
funcional de cada uno de los componentes del sistema del complemento. Sin
embargo, estos métodos son metodológicamente muy complejos y relativamente
caros, por lo que su uso se restringe a laboratorios especializados en este campo.
Determinación del complemento hemolítico total por medio de placa de IDR
El kit del complemento hemolítico total fue diseñado para detectar deficiencias en
la vía clásica del complemento y los componentes de la vía común.
38
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Síntesis de Fármacos
Esta prueba puede ser empleada en el monitoreo de la actividad total del
complemento, por lo que su utilidad clínica se encuentra como prueba de tamizaje
para personas con defectos del sistema del complemento.
Objetivo general
¾ Comprender el proceso de una reacción de inflamación.
Objetivo particular
¾ Identificar las células del sistema inmune en respuesta a una lesión
inflamatoria.
Recursos
•
•
•
•
Material
1 placa de IDR complemento.
1 jeringa 3 ml.
2 tubos de ensayo de 10 x 75 ml.
1 pipeta Pasteur con bulbo.
Reactivos
Equipo
N/A
• Centrífuga clínica.
Procedimiento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Extraer 3 ml de sangre y colocarla en un tubo de ensayo de 10 x 75 ml.
Centrifugar a 2,000 rpm para separar el suero.
Colocar 0.5 µl de suero en una de las horadaciones de la placa.
Colocar los controles necesarios.
Incubar de 24 a 48 horas.
Medir el halo de hemólisis formado y elaborar una curva con los datos
obtenidos.
7. Calcular concentración y reportar.
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Cuál es la función del sistema del complemento?
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39
Síntesis de Fármacos
2. ¿Cuáles son los factores que participan en la vía común del complemento?
3. ¿A qué tipo de inmunidad corresponde el sistema del complemento?
4. ¿Cuáles son las principales moléculas de origen microbiano responsables de
activar el complemento?
5. Mencione tres patologías que alteran las concentraciones de los niveles del
complemento y describa si aumentan o disminuyen sus valores.
B) Diagrama de la determinación del complemento por IDR.
40
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Síntesis de Fármacos
Resultados
Observaciones
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41
Síntesis de Fármacos
Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
Página Editorial
1.
2.
3.
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
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Síntesis de Fármacos
Práctica Nº 8
Identificación de células LE (lupus eritematoso)
Fundamento
Una de las principales características del sistema inmune es que, en condiciones
normales, no reacciona contra sus propios constituyentes. Hay diversos
mecanismos que permiten al sistema inmune tolerar lo propio e identificar y
destruir lo extraño, pero en ocasiones estos mecanismos se pierden y el sistema
inmune genera autoanticuerpos, lo cual puede que no genere problemas, o de lo
contrario, que se desarrolle una enfermedad autoinmunitaria.
Según la teoría de eliminación clonal de Burnet, todos los individuos deben
nacer carentes de las clonas celulares capaces de reconocer a los antígenos
propios y, por lo tanto, incapaces de desarrollar respuestas autoinmunes. Sin
embargo se presentan las enfermedades autoinmunes, para lo cual existen varias
explicaciones: tolerancia inmunológica y supresión activa, liberación de antígenos
secuestrados, reactividad cruzada (mimetismo molecular), activación policlonal,
factores genéticos, antígenos HLA y autoinmunidad.
Existen muchas enfermedades autoinmunes. Se pueden clasificar
principalmente en enfermedades de órganos específicos y enfermedades sin
órgano específico (sistémicas). En las enfermedades de órganos específicos los
anticuerpos se dirigen contra componentes del órgano afectado; un ejemplo son
las enfermedades tiroideas autoinmunitarias, que comprenden tres tipos:
enfermedad de Graves o hipertiroidismo, enfermedad de Hashimoto o
hipotiroidismo y mixedema, con ausencia total de función tiroidea. En las
enfermedades sin órgano específico, los anticuerpos no están dirigidos contra un
componente en especial, sino que atacan a varios componentes de varios
órganos, un ejemplo de esto es el lupus eritematoso sistémico.
Debido a la gran variedad de enfermedades autoinmunes, no sólo se
clasifican dependiendo de su extensión como órgano-específicas y órganoinespecíficas, sino que también se clasifican respecto a su relación con los
antígenos de clase I o II del CMH.
El lupus eritematoso sistémico (LES) se caracteriza por afección cutánea en
la cara en forma de alas de mariposa (eritema) y afección a varios órganos; es una
enfermedad multisistémica crónica con remisiones y reactivaciones. Afecta
principalmente a las mujeres entre 20 y 60 años de edad, con una relación
mujer:hombre de 10:1. En esta enfermedad se encuentran autoanticuerpos contra
ADN y autoanticuerpos contra diversos constituyentes celulares; los complejos
inmunitarios formados se depositan en varios sitios, estimulando la inflamación
generalizada, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos y la activación de
fagocitos. Los anticuerpos que se encuentran más frecuentemente en estos
pacientes son los anticuerpos antinucleares anti-ADN, anticuerpos contra las
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43
Síntesis de Fármacos
ribonucleoproteínas, contra histonas y antígenos nucleorales, contra eritrocitos y
plaquetas, entre otros.
Las principales manifestaciones clínicas son: erupciones cutáneas, artritis,
glomerulonefritis, vasculitis de pequeñas arterias en todo el cuerpo, anemia
hemolítica, trombocitopenia y afectación del sistema nervioso central (SNC). La
prueba fundamental para el diagnóstico de la enfermedad es la presencia de
anticuerpos antinucleares (anticuerpos contra el ADN nativo de doble cadena).
Prueba para el lupus eritematoso sistémico
Es una prueba que tiene como objetivo determinar la presencia de un tipo especial
de células que indican dicho padecimiento, por lo tanto se utiliza como prueba
diagnóstica de LES. La forma en que se efectúa el examen es la siguiente: se
extrae sangre venosa en un frasco hermético o jeringa; en bebés o niños
pequeños se punza con una aguja o lanceta y se recoge la sangre en un tubo
pequeño de vidrio, en una lámina de vidrio o en una tira de examen;
posteriormente se prepara la muestra y se buscan al microscopio las células LE.
El valor normal de esta prueba es la ausencia de dichas células; en presencia de
valores anormales se debe descartar artritis reumatoide con esclerodermia y
sensibilidad a los medicamentos, pues en ocasiones estos pacientes muestran un
examen de células LE positivo. Los pacientes con LES que presentan un examen
positivo varían de 50 a 75 %.
Objetivos generales
¾ Conocer los principios básicos de la autoinmunidad.
¾ Identificar qué enfermedades se consideran autoinmunes.
Objetivos particulares
¾ Conocer las características del lupus eritematoso sistémico.
¾ Identificar las células LE (lupus eritematoso).
Recursos
Material
• Cápsula de porcelana.
• Tubo de Wintrobe.
• Portaobjetos.
44
Reactivos y muestras
• Muestra de sangre en
tubo seco.
• Colorante de Wrigth.
Equipo
• Incubadora.
• Microscopio óptico.
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Síntesis de Fármacos
Procedimiento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Se obtiene la muestra de sangre y se deja coagular.
Con ayuda de aplicadores, eliminar la mayor cantidad de fibrina de la muestra.
Incubar la muestra a 37 °C durante 2 horas.
Decantar el suero liberado y comprimir el paquete en una malla para que el
coágulo se quede en ella, en tanto las células y el suero pasan a la cápsula de
porcelana.
La muestra traumatizada se pone en tubos de Wintrobe y se centrifuga durante
10 minutos.
Se hace un frotis y se tiñe con la técnica de Wrigth.
Se observa el frotis con el microscopio con el objetivo 40X, buscando posibles
células LE, y se verifican con el objetivo 100X.
Para dar un resultado, observar por lo menos 500 PMN.
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Qué es una enfermedad autoinmune?
2. Mencione las posibles explicaciones para una enfermedad autoinmune.
3. ¿Cómo se clasifican las enfermedades autoinmunes?
4. Mencione por lo menos tres ejemplos de enfermedades autoinmunes órganoespecíficas.
5. Definición de lupus eritematoso sistémico.
6. ¿Cuáles son los autoanticuerpos que más frecuentemente se encuentran
en LES?
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45
Síntesis de Fármacos
7. Mencione las principales manifestaciones clínicas del LES.
8. ¿Cuál es la prueba diagnóstica del LES y en qué se basa?
B) Diagrama de flujo
46
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Síntesis de Fármacos
Resultados
Observaciones
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47
Síntesis de Fármacos
Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
Página Editorial
1.
2.
3.
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
48
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Síntesis de Fármacos
Práctica Nº 9
Inmunología del cáncer
Fundamento
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se proyecta que para el
año 2020 habrá 15 millones de casos nuevos de cáncer por año. En nuestro país
el cáncer es la segunda causa de muerte.
La inmunología del cáncer estudia el reconocimiento y la respuesta del
sistema inmune contra las células cancerosas. Su estudio abarca desde la
transformación maligna de las células, el entendimiento de los tumores y la
evasión del sistema inmune, hasta la aplicación en oncología con fines
preventivos, diagnósticos y de tratamiento (inmunoterapia).
En la mayor parte de los órganos y tejidos se conserva un equilibrio entre la
renovación y muerte celular. En circunstancias normales, la producción de nuevas
células es regulada por diversos mecanismos para que el número de cualquier tipo
particular de éstas se conserve constante. Sin embargo, en ocasiones aparecen
células que no están reguladas por los mecanismos normales de crecimiento, y
pueden dar lugar a clonas que producen un tumor o neoplasia. El cáncer es, en
realidad, un grupo de enfermedades caracterizadas por una serie de cambios en
el genoma de las células.
La oncogénesis es un proceso representado por la activación de oncogenes
y la pérdida de la función de los genes supresores. En general, las características
distintivas del cáncer comprenden la autosuficiencia en señales de crecimiento,
insensibilidad a las señales de regulación del crecimiento, escape de los
mecanismos de apoptosis, replicación sin límite, fomento de la angiogénesis,
evasión del sistema inmune, invasión y metástasis. Se han podido identificar
algunos de los mecanismos que utilizan los tumores para evadir la respuesta
inmunológica, entre ellos la escasa inmunogenicidad de los antígenos tumorales,
el acelerado crecimiento tumoral que llega a rebasar la velocidad de la respuesta
inmune, la ausencia o enmascaramiento de las moléculas del CMH I, la secreción
de factores que inhiben la activación de la respuesta inmune, entre otros.
La capacidad del sistema inmune para discriminar entre células normales y
células tumorales es crítica para permitir la destrucción del tumor efectivamente. Si
las células tumorales expresan moléculas que actúan como antígenos no propios
para el hospedero, antígenos nuevos que surgen durante el proceso de
transformación maligna celular, es posible que el sistema inmune sea capaz de
reconocer y destruir a estas células anormales mediante diversos mecanismos,
como la respuesta específica por linfocitos T y anticuerpos, o por medio de
componentes de la inmunidad innata como las células dendríticas, macrófagos y
células NK. Gracias a esto podemos clasificar a los antígenos tumorales según la
respuesta que ocasionen: respuesta humoral (anticuerpos), generación de
células CD4+ y generación de células CD8+ (citotóxicas).
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49
Síntesis de Fármacos
Algunos de los antígenos presentes en el cáncer se usan para monitorear el
curso del tumor; en el caso de los antígenos reconocidos por linfocitos T, son más
relevantes para evaluar el rechazo a los tumores. Los antígenos reconocidos por
los linfocitos T se pueden agrupar en cuatro categorías: en el primer grupo se
encuentran las mutaciones somáticas, son los antígenos presentes en un tumor
específico de un individuo; en el segundo grupo encontramos los antígenos
específicos de un tumor pero que se encuentran en diferentes individuos, un
ejemplo son los antígenos virales; en el tercer grupo entran los antígenos producto
de genes normales con una distribución restringida en los tejidos; por último, en el
cuarto grupo se incluyen los antígenos compartidos en los tejidos, lo cual implica
un reconocimiento autorreactivo.
Uno de los numerosos retos de la inmunoterapia es contrarrestar los
mecanismos de evasión, al mismo tiempo que se estimulan formas eficientes de
respuesta inmune contra las células cancerosas. Por esto la inmunoterapia se
basa en varios métodos que incluyen el uso de antígenos (lisado de tumor,
proteínas tumorales, péptidos sintéticos y ADN), células activadas (células
dendríticas, células T citotóxicas y células NK), anticuerpos específicos, citocinas
conjugadas o modificadas y terapia génica.
Objetivo general
¾ Conocer los principios básicos del cáncer.
Objetivo particular
¾ Conocer los mecanismos que utilizan las células tumorales para evadir al
sistema inmune.
Principio básico del método
El modelo de ratones con linfoma murino L-5178-Y representa un buen ejemplo de
supresión de la respuesta inmune celular, mediante los diferentes mecanismos de
evasión inmunológica. En este caso, la inmunosupresión se logra gracias a la
acción supresora de una glucoproteína presente en el líquido ascítico y plasma de
estos ratones.
La inmunosupresión se verifica mediante la prueba del dinitro-fluoro-benceno
(DNFB); este agente ocasiona una reacción de hipersensibilidad tardía que refleja
lo que sucede en la respuesta inmune celular contra microorganismos. Mediante
esta prueba se puede apreciar la reacción de hipersensibilidad tardía en el grupo
control, mientras que en el grupo experimental, inmunosuprimido por el linfoma, no
se consigue dicha reacción.
50
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Síntesis de Fármacos
Recursos
Material
• Ratones cepa Balb/c.
• Torundas con alcohol.
• Jeringas de 1 ml (para insulina).
• Navajas para rasurar.
• Guantes de látex.
• Gasas.
Reactivos
Equipo
N/A
• Linfoma L-5178-Y.
• Solución salina fisiológica 0.9 %.
• PBS (solución salina de fosfatos).
Procedimiento
Parte A. Inoculación del tumor
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Rasurar la región cervical derecha de 4 ratones.
Marcar a dos de los ratones como control y a los otros dos como
experimentales.
Inocular en un ratón experimental 10 millones de células tumorales en 200 ul
de solución de Hanks.
Administrar a los ratones controles 200 ul de solución de Hanks.
Transcurridos 8 días se hará la prueba de hipersensibilidad retardada con el
DNFB, para evaluar la respuesta inmune celular.
Obtener células tumorales de los ratones inoculados previamente.
Elaborar un frotis de células tumorales y teñirlo con la técnica de Wright.
Observar al microscopio y describir las células encontradas.
Parte B. Prueba de hipersensibilidad tardía al DNFB
(Siguiente práctica)
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Qué estudia la inmunología del cáncer?
2. ¿Qué es la oncogénesis?
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51
Síntesis de Fármacos
3. Mencione los mecanismos que utilizan los tumores para evadir la respuesta
inmunológica.
4. ¿Qué le permite al sistema inmune discriminar entre células normales y
tumorales?
5. ¿Cómo se clasifican a los antígenos tumorales según la respuesta que
producen?
6. ¿Cómo se agrupan los antígenos reconocidos por linfocitos T?
7. Mencione el objetivo de inocular a los ratones con el linfoma y cómo se
demuestra la presencia del mismo.
B) Diagrama de flujo
52
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Síntesis de Fármacos
Resultados
Observaciones
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53
Síntesis de Fármacos
Conclusiones
Bibliografía
Título
1.
2.
3.
Autor
Página
Editorial
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
54
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Síntesis de Fármacos
Práctica Nº 10
Hipersensibilidad tardía e inmunodeficiencia
Fundamento
La hipersensibilidad tardía también es llamada ‘hipersensibilidad de tipo IV’, o
‘mediada por células T’. Este tipo de reacción desempeña un importante papel en
la defensa del huésped contra agentes ambientales o químicos y microorganismos
intracelulares. Cuando algunas poblaciones de células TH activadas se encuentran
con ciertos tipos de antígenos, comienzan a secretar citocinas que inducen una
reacción inflamatoria localizada (reacción de hipersensibilidad tardía); este
reconocimiento y eliminación del agente infeccioso o antígeno extraño son el
resultado del sistema inmune adaptativo, por medio de sus mecanismos
humorales y celulares.
Cuando un individuo se expone a un antígeno, se dice que se «sensibiliza»;
las células presentadoras de antígeno ayudan a que los linfocitos TH reconozcan
al antígeno procesado y se activen, diferenciándose en linfocitos TH1. Si el
individuo se vuelve a exponer al mismo antígeno, las células TH1 lo reconocen,
secretando citocinas y quimiocinas que atraen y activan a macrófagos y otras
células inflamatorias inespecíficas, lo cual establece la reacción de
hipersensibilidad tardía.
La reacción de hipersensibilidad tardía puede ser inducida de forma
experimental en un laboratorio, en modelos animales. El proceso incluye desde la
fase de sensibilización, donde el animal entra en contacto por primera vez con el
agente sensibilizante o antígeno mediante la aplicación por contacto o cutánea; el
agente aplicado es reconocido y procesado por las células presentadoras de
antígenos, que lo presentan a los linfocitos T. Cuando los linfocitos T reconocen el
antígeno como algo extraño, se activan y desencadenan una respuesta específica
contra él; al final de esa respuesta, algunos linfocitos se diferenciarán en células
de memoria. Si posteriormente el animal es expuesto a ese mismo agente, se
desencadenará la reacción de hipersensibilidad tardía durante las próximas 24 a
48 horas, caracterizándose por enrojecimiento e induración del tejido expuesto.
Objetivo general
¾ Identificar y comprender las reacciones de hipersensibilidad tardía o de tipo IV.
Objetivos particulares
¾ Identificar las diferentes fases de una reacción de hipersensibilidad tardía
mediante la prueba del DNFB.
¾ Comprender la relación entre la inmunosupresión y la eliminación de la
respuesta de hipersensibilidad tardía.
¾ Evaluar el estado de la respuesta inmune celular en el modelo animal.
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55
Síntesis de Fármacos
Principio básico del método
La inmunosupresión en el modelo de ratones con linfoma murino L-5178-Y se
hace patente mediante la prueba del DNFB, que causará una reacción de
hipersensibilidad retardada en los ratones control, mientras que en los ratones
experimentales esta reacción se verá suprimida.
Se sensibiliza a los ratones con el DNFB, el cual funciona como un hapteno
en unión a proteínas de la dermis. Este complejo es reconocido por las células de
Langerhans, las cuales lo procesan y presentan a los linfocitos T en los ganglios
más cercanos, esto activa los linfocitos TH1, ahora capaces de reconocer al
complejo en la dermis. Cuando se aplica una dosis de DNFB, se forma el complejo
en la dermis y al ser reconocido por los linfocitos TH1, se producen IFN-g e IL-17,
los cuales a su vez estimulan la producción de IL-1, IL-6, GM-CSF, TNF-a y
diferentes quimiocinas por parte de los queratinocitos y células inflamatorias; las
citocinas y quimiocinas promueven la respuesta inflamatoria, la llegada de
monocitos que se convierten en macrófagos y la llegada de más linfocitos, lo que
instaura la reacción de hipersensibilidad retardada.
Recursos
Material
• Ratones cepa Balb/c (se usarán
los ratones experimentales y
controles de la práctica anterior).
• Hoja de rasurar.
• Aplicador de plástico.
• Jeringas para insulina.
• Guantes de látex.
• Gasas.
Reactivos
• Dinitrofluorobenceno
(DNFB).
• Acetona.
• Aceite de oliva.
Equipo
• Micrómetro de
precisión.
Procedimiento
Prueba de hipersensibilidad tardía al DNF
1. Rasurar la región abdominal de los ratones.
2. Tomar un ratón control y otro experimental de los dos ratones previamente
inoculados con el linfoma, y de la misma manera se tomará un ratón control y
uno experimental de los ratones sanos.
3. Sensibilizar a los dos ratones experimentales con una dosis de 20 ul de DNFB
al 0.5% en una mezcla de acetona y aceite de oliva, en proporción 4:1 (v/v), en
la región del abdomen previamente rasurada.
4. Sensibilizar los dos ratones de control con 20 ul de solución salina fisiológica al
0.9 %, en la región del abdomen previamente rasurada.
5. Aplicar luego de 24 horas después un segundo reto de 20 ul de DNFB a los
ratones experimentales y 20 ul de solución salina al 0.9 % a los ratones control.
56
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Síntesis de Fármacos
6. A los 5 días se aplicará un tercer reto con 20 ul de DNFB a los ratones
experimentales y 20 ul de solución salina al 0.9% a los ratones control.
Además de la aplicación en la región abdominal, aplicar en el pabellón
auricular derecho 10 ul de DNFB a todos los ratones (experimentales y
control). Antes de aplicar en el pabellón, medir su grosor con el micrómetro.
7. Esperar 48 horas y medir nuevamente el grosor del pabellón auricular derecho
de cada ratón, para verificar la reacción de hipersensibilidad. Calcular la
diferencia existente entre ambas mediciones y anotar la conclusión.
Actividades
A) Cuestionario
1. Explique el proceso de una reacción de hipersensibilidad tardía.
2. ¿Cuáles son las células mediadoras de las reacciones de sensibilidad tardía y
qué otras células participan?
3. ¿De qué manera se puede inducir de forma experimental una reacción de
hipersensibilidad tardía?
4. ¿Cuál es la aplicación clínica de las reacciones de hipersensibilidad tardía?
5. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de reacción de hipersensibilidad tardía
al DNFB?
6. ¿Qué cuidados se deben tener al manejar el DNFB y cuáles son los riesgos?
7. Mencione la clasificación de Coombs y Gell para las reacciones de
hipersensibilidad y dé un ejemplo de cada una.
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Síntesis de Fármacos
B) Diagrama de flujo
Resultados
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Observaciones
Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
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2.
3.
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
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Síntesis de Fármacos
Práctica Nº 11
Inmunología de los trasplantes
Fundamento
En inmunología, el término ‘trasplante’ se refiere a la acción de transferir células,
tejidos u órganos de un individuo a otro; esto se justifica en la posibilidad de curar
muchas enfermedades al reemplazar un tejido dañado por uno sano. El objetivo es
mantener la integridad funcional del tejido trasplantado en el receptor y así suplir la
falla orgánica preexistente.
En ocasiones es crucial efectuar un trasplante para evitar la muerte del
paciente. El mayor problema que se presenta en esta situación es la disponibilidad
de los tejidos y el rechazo que se puede presentar en el receptor.
El sistema inmune tiene una participación muy importante al hacer un
trasplante, pues de esto depende la supervivencia o rechazo de éste. Para ayudar
a la supervivencia de los injertos se utilizan diferentes agentes inmunosupresores,
como fármacos y anticuerpos específicos desarrollados para disminuir el ataque
del sistema inmune hacia el injerto. La desventaja que tiene esto es que los
agentes inmunosupresores actúan de manera sistémica y ponen al individuo en
riesgo, haciéndolo susceptible a infecciones y otras enfermedades.
Debido a que la inmunorreacción a los antígenos tisulares del complejo
mayor de histocompatibilidad (CMH) es la principal razón para el rechazo, la
compatibilidad entre el receptor y el donante se evalúa mediante la tipificación de
los antígenos tisulares de CMH clases I y II.
El grado de inmunorreacción que causa el injerto en el receptor depende de
la naturaleza del mismo; se pueden clasificar los injertos en cuatro tipos:
•
•
•
•
Autoinjerto. Es el tejido del mismo individuo transferido de una a otra parte del
cuerpo.
Isoinjerto. Es el tejido que se transfiere entre individuos genéticamente
idénticos.
Aloinjerto. Es el tejido que se transfiere entre individuos de la misma especie
pero genéticamente diferentes.
Xenoinjerto. Es el tejido transferido entre individuos de diferentes especies.
Los autoinjertos y los isoinjertos generalmente son bien aceptados en el individuo;
el aloinjerto tiene cierto grado de rechazo debido a que el sistema inmune lo
reconoce como algo extraño; el xenoinjerto es el que presenta rechazo con mayor
intensidad, debido a la gran diferencia genética entre los individuos.
El rechazo de un injerto es la inmunorreacción que presenta reconocimiento
de lo propio y lo extraño, especificidad y memoria. Estas reacciones de rechazo se
clasifican en tres:
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Rechazo hiperagudo. Está mediado por anticuerpos preexistentes en el
receptor contra los antígenos del injerto.
Rechazo agudo. Está mediado por linfocitos TH y células citotóxicas.
Rechazo crónico. Está mediado por componentes humorales y celulares.
Se pueden describir dos etapas cuando se presenta un rechazo. La primera es la
etapa de sensibilización, en la que se estimulan y activan los linfocitos T; la
segunda es la efectora, durante la cual se produce el ataque al injerto.
Trasplante de piel
La piel es el órgano más grande del cuerpo. Está encargada de proporcionar al
organismo una barrera protectora contra el medio ambiente, por esto es esencial
en la homeostasis, control de la temperatura, intercambio de fluidos con el exterior
y, por supuesto, es el principal mecanismo de defensa contra microorganismos
invasores. Su alta especialización hace que el trasplante de piel sea una prueba
de histocompatibilidad muy rigurosa, ya que prácticamente todos los antígenos se
encuentran ahí. Los injertos de piel son «de primera intención», esto es, que su
vasculatura se establece por anastomosis directa termino-terminal entre los vasos
del injerto y los vasos del receptor.
La evolución en los injertos de piel es rápida. En los primeros días no se
observan grandes diferencias en los tejidos, dentro de las primeras 24 horas todos
los injertos se aprecian pálidos y es hasta el segundo día que aparecen manchas
de color rosado. En el tercer y cuarto día todo el injerto se ve de color rosado
uniforme, para el quinto día comienza a desaparecer el edema y eritema, hay
regeneración epidérmica y fusión gradual del injerto con la piel del huésped. Para
el vigésimo día ya se observa un patrón de vasculatura similar al de la piel
circundante.
En caso de que se presente un rechazo al injerto, dentro de la primera
semana se observa un halo de edema y eritema que se incrementa durante los
subsiguientes; para el octavo y noveno días el color del injerto cambia a rojo
cereza, progresando a cianosis franca. Después de esto se presenta punteado
trombótico, escarificación y hemorragia en los siguientes días. Al final del proceso
de rechazo se pierde por completo el flujo sanguíneo y el injerto se convierte en
una escara negra que se esfacela.
Los criterios de diagnóstico para el rechazo de autoinjerto de piel son los
siguientes:
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Intensidad del eritema y edema circundantes.
Color y consistencia del injerto.
Valoración microscópica de la vasculatura superficial.
Presencia o ausencia de trombosis o hemorragia.
Basándose en estas observaciones se determina un criterio específico para
diagnosticar el rechazo, basándose en lo siguiente:
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Desarrollo de edema y eritema intensos alrededor del injerto.
Color rojo oscuro o cianosis del injerto.
Edema y opacificación de la superficie del injerto.
Interrupción del flujo sanguíneo en todos los vasos del injerto.
Presencia de trombosis intravascular y hemorragia.
Escarificación y esfacelación del injerto.
Objetivo general
¾ Comprender la participación del sistema inmune en los trasplantes.
Objetivos particulares
¾ Identificar los efectos de un trasplante de piel en un modelo murino.
¾ Evaluar la evolución en un trasplante de piel.
Recursos
Material
• Ratones de la cepa Balb/C, DBA.
• Cajas de Petri.
• Pipetas Pasteur.
• Bulbos de succión.
• Estuche de disección.
• Navajas de rasurar.
• Sutura de seda 3-0.
• Gasas.
• Guantes.
• Cubrebocas.
Reactivos
• Anestesia pentobarbital
sódico o Zoletil. ®
• Solución fisiológica.
Equipo
N/A
Procedimiento
1. Se anestesia a los ratones con 2 ml de pentobarbital sódico vía intraperitoneal.
2. Rasurar el dorso de los ratones y delinear la piel a trasplantar, cuidando que
sean las mismas dimensiones en el donador y el receptor.
3. Cortar con bisturí la zona delineada y disecar el tejido con mucho cuidado con
tijeras curvas.
4. La piel separada del dorso de los ratones se colocará en las cajas de Petri con
solución salina fisiológica al 0.9 % a temperatura ambiente, cuidando que los
injertos no se sequen. Cuidar también que no se seque en ningún momento la
zona descubierta de los ratones.
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5. Implantar el tejido en la zona destinada como receptora. Es importante que los
bordes queden bien alineados para garantizar el contacto y la irrigación del
injerto. El injerto se fija con puntos simples, utilizando la sutura de seda 3-0.
6. Dejar a los ratones en su jaula y agregar al agua un antihistamínico.
7. Evaluar la evolución del trasplante y registrar los cambios en los injertos
durante los siguientes 15 días.
Actividades
A) Cuestionario
1. ¿Qué es el trasplante y con qué objetivo se realiza?
2. ¿Cómo participa el sistema inmune en la evolución de los trasplantes?
3. Mencione la importancia del CMH en la inmunología de los trasplantes.
4. Mencione los tipos de injertos y sus características.
5. Describa los tipos de rechazo que se pueden presentar.
6. Describa brevemente el proceso del rechazo, sus etapas y las células del
sistema inmune que participan.
7. ¿Qué cambios se observan en la primera semana después de un trasplante
de piel?
8. ¿Cuáles son los criterios finales para diagnosticar rechazo en un trasplante
de piel?
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9. ¿Cómo se puede evitar el rechazo de los trasplantes y qué riesgos conlleva?
10. En caso de presentarse el rechazo, ¿cuáles son las medidas a aplicar?
B) Diagrama de flujo.
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Resultados
Observaciones
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Conclusiones
Bibliografía
Título
Autor
Página Editorial
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Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
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Bibliografía
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Madrid, España.
Kindt, T.: Inmunología de Kuby, 6ª edición, editorial McGraw-Hill (2007), México.
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