膀胱肿瘤中EphA2 mRNA的表达 及其生物学行为关系研究 董自强 胡敬祖

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・38・
实验研究
膀胱肿瘤中EphA2 mRNA的表达
及其生物学行为关系研究
董自强
张平
胡敬祖
毛峥
陈晓波
陈晓春
doi:10.3870/j.issn.1674—4624.2010.01.012
【摘要】
目的研究受体酪氨酸激酶EphA2在膀胱肿瘤中的mRNA表达,并对其致癌机制
加以初步探讨。
方法
应用实时荧光定量RT-PCR技术检测49例膀胱尿路上皮癌(bladder
carcinoma,BUC)、19例膀胱内翻性乳头状瘤(inverted papilloma of blader,IPB)和10例
urothelial
结果
正常膀胱组织标本中EphA2 mRNA的表达,并通过2也△c7方法分析相对基因表达的差异。
相对于正常膀胱组织,EphA2 mRNA在IPB和BUC中的表达量明显增加,分别平均上调约2.06
(2.06士0.84)倍和2.57(2.57士0.97)倍;在IPB与BUC组间的表达差异无统计学意义(P>
0.05)。EphA2
tuRNA的表达与膀胱肿瘤临床分期(r=0.471,P=0.001)及病理分级(r一---0.286,
P=0.047)呈正相关,与BUC其它各临床病理特征之间没有相关性(P>o.05)。
结论
EphA2
过表达可能促成了IPB的癌性转化以及膀胱肿瘤的恶性进展,其核酸调控机制可能发生在膀胱肿
瘤早期,甚或更有可能是在癌前病变进展期中起重要作用。
【关键词】膀胱肿瘤;
A study
on
EphA2;
实时荧光定量RT-PCR
the expression of EphA2 mRNA in bladder tumor and its relationship of biological behaviour
ZHANG Ping。。DONG Zi—qiang,MAO Zheng,HU Jing—ZU,CHEN Xiao—bo,CHEN Xiao-
chun.’Yichang Central People’S
Hospital,the First College of Clinical Medical Science,China
Three Gorges University,Yichang 443003,China
Corresponding author:DONG
[Abstract]Objective
Zi—qiang,E-mail:yczxyymw@yahoo.corn.cn
To investigate the mRNA expression
its role in carcinogenic mechanism.
with real—time
reverse
Methods
of EphA2 in bladder tumor and
The expression of EphA2 mRNA were determined
transcriptase polymerase chain reaction(real—time RT-PCR)in 49
bladder
urothelial carcinoma(BUC),19 inverted papilloma of the bladder(IPB)and 10 normal bladder tis—
sues.and then the relative gene expression of EphA2 were studied by 2--An“method.
Comparing
to
Results
normal tissues,the expressions of EphA2 tuRNA in IPB and BUC tissues increased
spectively about 2.06(2.06士0.84)and 2.57(2.57士0.97)times
on
the average;There were
tistical differences of EphA2 mRNA expressions between IPB and BUC
no
re—
sta—
groups(P>0.05);EphA2
mRNA expressions were positively correlated with the clinical stage(r=0.471,P一0.001)and path.
ological grade of BUC(r=0.286。P一0.047)and there were
sions and
any
other clinic and pathological features of
ble that EphA2 overexpressions facilitated IPB
transforme into
motions of bladder tumor;the nucleic acid regulation
role during the early formation and
progress
no
correlations between EphA2
BUC(P>0.05).
cancer
Conclusions
as
well
as
expres—
It was possi—
the malignant pro—
mechanism of EphA2 may play
an
important
of bladder tumor.
[Key words]Urinary bladder neoplasms;EphA2;Real—time RT—PCR
EphA2作为受体酪氨酸激酶家族中的一员,参
与调控机体细胞生长、生存及迁移等多种生物学行
为[1]。近来研究表明,EphA2蛋白过表达促进了肿
作者单位:443003三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医
瘤细胞的恶性进展[2]。为深入了解EphA2与人体
院(张平、董自强、毛睁,胡敬祖、陈晓渡);华中科技大学同济医学院
肿瘤演进的关系及其临床意义,我们从mRNA水
附属协和医院(陈晓春)
平检测了EphA2在正常膀胱组织、膀胱内翻性乳头
通讯作者:董自强,E-mail:yczxyymw@yahoo.corn.cn
万方数据
状瘤(inverted
papilloma of bladder,IPB)及膀胱尿
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路上皮癌(bladder
carcinoma,BUC)组织
差不齐时使用Tamhane’S方法,两变量间相关分析
中的表达情况,并结合已有蛋白水平的研究,对其致
采用Spearman等级相关分析。以P<O.05为差异
癌机制加以初步探讨。
有统计学意义。
urothelial
材料与方法
结
一、实验材料
果.
一、EphA2 mRNA表达的差异
收集2005年6月~2008年6月本院手术切除
相对于正常膀胱组织,EphA2 tuRNA在IPB
的BUC新鲜组织标本49例;收集2003年6月~
和BUC中的表达量明显增加,分别平均上调约
2008年6月同济医学院附属同济、协和医院及本院
2.06(2.06土0.84)倍和2.57(2.57土0.97)倍,但
和本区属协作医院送检的IPB组织标本19例;另取
在IPB与BUC组间的表达差异无统计学意义
10例正常膀胱组织作为对照。所有标本均经病理
(P>0.05)。不同临床分期BUC组织中EphA2
证实。膀胱癌病例中,男性29例,女性20例,年龄
mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。不同
33~81岁,平均58.5岁。根据国际抗癌联盟
病理分级的BUC组织中,中分化与低分化组间E—
(UICC,2002)和wH01973标准,临床分期T。~
phA2
T。期16例,T。~T。期20例,T。期13例;病理分
余各组间的表达差异有统计学意义(P<O.05)。其
级G。级12例,G:级23例,G。级14例;肿瘤直径
它临床病理特征组间比较EphA2 mRNA的表达差
R≤2 cm 9例,2 cm<R≤5
cm 30例,R>5 cm 10
异无统计学意义(P>O.05),见表1。
例;单发16例,多发33例。所有病例术前均未接受
放疗或化疗。标本离体经液氮速冻后置一80℃冰
mRNA的表达无统计学意义(P>0.05),其
二、EphA2 mRNA表达与膀胱癌临床病理特
征的相关性
箱保存。
Spearman等级相关分析表明EphA2
mRNA
二、实时荧光定量RT-PCR检测法
的表达与膀胱尿路上皮癌的临床分期(,.一0.471,
采用Trizol试剂盒(invitrogen)提取组织样本
P=0.001)和病理分级(r=0.286,P=0.047)呈正
总RNA。运用逆转录试剂盒(MBI)按其实验流程
相关,同BUC其它各临床病理特征之间没有相关
合成样本cDNA。特异性引物由上海生工合成,E—
性。
phA2上游:5,_CACTTACCGCAAGAAGGGAG一
3’,下游:5,-CACCAGAAGCAGGACCACA一3’,拟
讨
论
扩增片段长度238 bp;内参照13-actin上游:5'-GG—
EphA2是受体酪氨酸激酶最大亚族一Eph受
5,-
体激酶家族中的一员。作为一个130 kD的跨膜受
GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’,拟扩增片段
体,其主要结合配体为EphrinAl。EphA2参与调
长度251 bp。反应体系:cDNA 3弘1,上游引物1肛l,
控诸如神经传导、血管形成以及细胞生长、生存、迁
Green I PCR Master Mix(in—
移等多种生物学行为,通常以相对较低的水平表达
vitrogen)10弘l,双蒸水5弘l,总反应体积20 pl,内参
相同。扩增条件:94℃预变性5 min;94℃变性
在成人各种上皮细胞中。人类EphA2基因定位于
GACCTGACTGACTACCTCA一3
下游引物1“l,SYBR
1 S;54℃退火15
7,
下
s;72℃引物延伸30
游:
S;78℃1
S
后读板,循环39次,72℃延伸10 rain,降温至65℃
染色体Ip36.1,含有17个外显子,该区在人体的多
种肿瘤中常有缺失L1J。
与其在正常上皮细胞中的表达相反,EphA2蛋
后按每步0.2℃的温度上升速率递增至98℃进行
白在诸如乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中过表
熔解曲线分析,72℃10 min后结束。
达且促进了肿瘤病变的恶性发展[2]。目前已将E—
三、EphA2 mRNA表达的相对定量分析
phA2认定为一种强力的致癌蛋白[2’3],其蛋白水平
实验检测确定2仓△cT方法的适用性后,以正常
的表达调控机制如下:在正常上皮组织中EphA2蛋
膀胱组织作为参照因子,经内标均一化处理后,通过
白与其配体EphrinAl的有效结合促使EphA2发
公式2-AACT计算出IPB和BUC组织中EphA2
生自体磷酸化[4’5],同时封阻了针对EphA2的特异
mR—
NA相对于参照因子的表达定量。
性酪氨酸磷酸酶(LMW—PTP)的活化位点从而阻断
四、统计学方法
了EphA2去磷酸化[6]。磷酸化的EphA2蛋白启动
应用SPSS 13.0统计软件,两组均数间比较采
了一系列信号级联,负向调控了细胞的生长、存活及
用t检验,多组均数间比较用方差分析s_N—K法,当
迁移∞]。EphA2的磷酸化同时也启动了其活化依赖
万方数据
塑垡鳖垦生堕壁堕室查垫!!生!旦箜!鲞箜!塑』鱼!坐!里g旦!!!垦!P!型!!!!型:壁!型!!z!!!!!!型!:型!:!
表1
临床病理学参数
EphA2
mRNA表达与膀胱癌各项临床病理特征的关系
例数
EphA2
年龄(岁)
<60
≥60
II:鼍攀。哿
对表达(2一△△cT均值)
2.49±O.95
埔姐
P值
0.648
P(,)值
P=0.512
(r=0.096)
2.62±O.99
性别
2.65士0.96
男
女
四加
0.498
P=0.726
(r=一0.051)
2.464-1.00
病理分级
G1
1.79士O.87
0.002▲
P=0.047
G2
2.98±1.02
0.i13◆
(r=0.286)
2.58士0.47
0.007●
G3
坨孙M
临床分期
T.~Tl
1.4l士0.09
T2~T3
3.62±O.22
T4
:2加¨
P一0.001
O.01
(r=0.471)
0.129
(r=0.260)
2.39士0.04
肿瘤大小(R)
R≤2 cm
2.16±1.12
2
2.58士0.94
em<R≤5 em
R>5 cm
0∞加
肿瘤数目(n)
<2
’≥2
2.92士O.87
2.61士1.04
¨∞
P=0.071
2.、56士O.95
0.855
P=0.769
(r=一0.043)
▲G1级与G2级比较;◆G2级与G3级比较;・G3级与Gl级比较
性的自体降解过程,完成信号传递的EphA2很快经
Pratt等[9]及Li等[10]新近的研究证实活化的
由蛋白酶体途径被降解[4]。因此,在正常上皮细胞
MAP/ERK信号传导上调肿瘤细胞中EphA2的基
中表现为EphA2蛋白低表达。而在肿瘤组织中,由
因表达,并通过转录翻译过程促进EphA2蛋白表达
于EphA2与其配体的结合障碍导致其蛋白不能发
增强。Pratt等进一步提出EphA2在细胞中的蛋白
生自体磷酸化,其亚细胞定位也发生了改变,解除了
水平是其基因及蛋白表达协同调控的结果,即不稳
针对LMW-PTP活化位点的空间位阻,促进了E~
定的细胞问连接导致EphA2在肿瘤细胞中只能短
phA2的去磷酸化[6]。磷酸化状态及空间定位的改
暂地与其配体结合,这一短暂的过程足以维续经由
变导致EphA2作用于不同的底物,信号传导发生改
ERK的信号传导但却不足以长到促发EphA2自体
变或启动了于正常细胞而言截然不同的传导通路,
磷酸化及内化降解,其结果是肿瘤细胞中EphA2基
其结果表现为促进了细胞的生长、存活、迁移及侵
因及蛋白表达均增高。本实验观察到T。~T。期膀
袭口’3]。配体结合障碍也阻断了EphA2的活化依
胱癌中EphA2 tuRNA的表达高于T。~T。期与T;
赖性的自体降解过程,因此在肿瘤细胞中可以检测
期癌症组织中的表达,最强的EphA2核酸表达并不
到高表达的去磷酸化的EphA2蛋白FA,S]。
像其蛋白那样见于最具恶性显型的癌症分组中。排
相对于EphA2蛋白表达而言,目前对其核酸表
除抽样误差的原因,实验结果提示EphA2的核酸调
达的调控机制知之甚少。最近有研究提示某些因素
控机制可能在膀胱肿瘤早期进展中(比如从T。~T。
可能促进了EphA2的基因表达增强[7.8],比如Ras
期进展到T。~T。期)起到了重要的作用。本实验
信号途径、p53突变及ER缺失等,但具体效应尚待
还观察到IPB中EphA2核酸水平呈高表达,且IPB
进一步证实。本实验中我们观察到膀胱肿瘤中E—
与癌症组中的表达差异无统计学意义,提示EphA2
mRNA的表达明显高于正常膀胱组织,另外,
过表达可能促成了IPB的癌性转化。鉴于IPB被
在不同临床分期与病理分级的膀胱癌组织中E—
认为是膀胱癌癌前病变之一,我们可以进一步作如
mRNA表达差异多有统计学意义,且其表达
下推论,即EphA2的核酸调控机制更突出的作用可
phA2
phA2
与膀胱癌临床分期和病理分级正相关。结果提示膀
能发生在肿瘤形成的起始阶段甚至更可能是在癌前
胱肿瘤的形成与发展也涉及到EphA2核酸水平的
病变进展期。
表达调控,EphA2过表达可能促进了膀胱肿瘤的恶
性发展。
万方数据
作为胞内信号级联的起始,EphA2涉及到一个
精细的传导及调控网络,许多环节亟待进一步研究。
・41
塑垡型鐾生堕壁塑盘查!!!!生!旦箜!鲞筮!塑』竺塑!!堡2旦!型曼!E!型!!!!型:壁!型!!!!!!!:!!!!!塑!:!
其独特的活化及代谢过程为深入探讨肿瘤的发生发
[61
the
展提供了许多有意义的靶点。相信随着对EphA2
[1]
Dodelet VC,Pasquale
embryogenesis
文
献
EB.Eph
receptors
and
ligands:
ephrin
[83
Zelinski
DP。Zantek ND,Stewart
pression
causes
[J].Cancer
[33
JC,et
tumo-rigenesis of
overex—
a1.EphA2
mammary
epithelial
[93
the
targeting of
inhibits malignant cell
Mol
151
Cancer
Zantek
is
induced
by
[10]
ligand
vJ].Cell
Growth
Cell
Pratt
Kinch
RL,
RNA
MS.Ligand
through the
Li
EphA2
by deoxycholic
a1.Estrogen
tyrosine
binding
up-regulates EphA2
protein/ex—-
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carcinoma cells,an
human colon
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p53一
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receptor tyrosine
(收稿日期:2009—05—30)
kinase
(本文编辑:徐汉玲)
logical
数更高。结合本研究及与前人研究相比,提示Fas—
cin基因在调节恶性肿瘤细胞的增殖、分化及细胞运
[4]
[5]
adhesion
and
motility[J1.
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L,et
and ki67
DNA,p53
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expression
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penile carci—
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[63
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[73
从目前的研究来看,Fascin蛋白在。肾细胞癌的
G,Zhang FR。Ren J,et a1.Expression
Chen
roid
发生、进展过程中发挥着重要作用,其可以作为一个
生物学标记,用于肾细胞癌的诊断和预后评估,并有
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分化增殖行为评估和分子靶向治疗带来新的希望。
Gentile
papillomavirus
响着恶性肿瘤的恶性程度、侵袭转移性能及预后。
前仍在研究中,如能明确其调节路径,则会对肿瘤的
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Curt Opin Cell
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[93
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apoptosis
EphA2
mitogen—-activated
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(上接第33页)
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(本文编辑:熊钰芬)
`